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如何构建基因表达载体

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如何构建基因表达载体

发布日期:2019-02-13 作者: 点击:

当我们拿到一个基因的DNA片段后,就需要把它导入一个载体,一方面长期保存。另一方面也需要以载体为媒介将基因导入受体细胞中。基因表达载体的构建是基因工程的核心。


常用的载体有细菌质粒,噬菌体和动植物病毒。其中质粒载体最常用。所谓载就是一个很长的环状DNA,携带一些基因,可以导入细菌中自我复制,也可以从细菌中提取出来改造。


现在我们就需要把SUN片段连到一个载体,我们直接问各个生物试剂、耗材公司的业务员:“我要做番茄转基因,你们那有可以做这个的载体吗?”然后从公司的网站上下载载体的序列,用VectorNTI打开,研究一下用哪个酶处理,如下图所示,这个载体需要用Sma1这个酶切开,然后用我们的SUN连上,替换切下来的ccdb,这里要用到两个酶,一个Sma1限制性内切酶切开,一个DNA连接酶把新片段连上,植物转基因载体和这些酶都是非常常用的试剂。


载体构建好之后需要把它们导入大肠杆菌中复制,这里就要用到大肠杆菌的感受态了,十几块一支,很便宜,把构建好的载体和感受态混合,然后放到42度热水处理个1分钟,再冰上放个3分钟,就搞定了。这时我们需要一些培养细菌的培养基来培养菌们,大肠杆君这种菌很好养活,毕竟在屎里都可以生存,唯一需要注意的是,灭菌过后的培养基要小心保存。把在冰上处理过的大肠杆菌放到培养基中培养一天,为了防止没有转入载体的菌也混进来,我们在载体上加入了一个抵抗抗生素的基因,这样我们在培养基中加入这种抗生素,在里面就只有我们需要的大肠杆菌能生长了。最后我们得到了上亿个携带着含有我们的SUN基因的载体的大肠杆菌,这时就需要把质粒再提出来。


一般实验室里提质粒需要用专门的试剂盒,我们也可以简化一下,先把菌液离心让菌沉淀,然后再用水把菌打散,然后煮沸1分钟再离心,取上清,上清中加乙醇让DNA析出,再离心让DNA沉淀,最后用水把DNA溶解。这样提出来的DNA会有很多杂质以及细菌的基因组DNA,但是我们不care,毕竟杂七杂八的东西也转不进农杆菌去。

基因表达

本文网址:http://www.igenebook.com/news/432.html

关键词:基因表达,基因调控,基因表达定量

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