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ChIP实验, 标签抗体你用对了吗?

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ChIP实验, 标签抗体你用对了吗?

发布日期:2019-03-27 作者: 点击:

在表观遗传学发展如火如荼的今天,ChIP-seq在研究蛋白质和DNA互作方面发挥巨大的作用,相较于酵母单杂、EMSA、双荧光素酶报告基因等技术手段,ChIP-seq真实反应活体细胞内DNA和蛋白质互作的状态,其结果可信度更高,说服力更强。

简单来讲,ChIP实验就是利用特异性抗体去免疫共沉淀DNA-蛋白复合体,降解掉蛋白之后对DNA进行研究的过程,合适的抗体将是ChIP实验的一个关键因素。那么如何去选择ChIP实验的抗体呢?看爱基百客接下来的介绍。

首先,利用CiteAb(http://www.citeab.com/)网站去查询,是否有市售商业化抗体。

基因表达调控

例如EZH2,Application选择ChIP,出现的45个抗体都是经过文献验证做过ChIP的。值得注意的是,这里的抗体也有ChIP和ChIP-seq之分,后者拥有更好的信噪比。


基因表达调控

基因表达调控

 


若有,那么恭喜你,你离成功近了一步,但是需要注意的是,2011年Nat Struct Mol Biol中曾对ChIP级别的抗体进行试验,结果只有78%的ChIP级别的抗体具有良好的特异性,同时,即使同一货号ChIP级别抗体,因批次的不同可能也会造成结果的差异。所以,当我们获得相应抗体时,一些相关的验证工作也是必不可少的。


如果没有ChIP级别的抗体,又该如何呢?一种选择是制备抗体,但是不一定在ChIP实验里有良好的表现,只能进行尝试。另外一种解决办法就需要今天的主角登场-----标签抗体,原理就是进行目的蛋白和标签蛋白融合表达,随后利用标签特异性抗体获得目的蛋白-DNA复合物。


现在常用的标签有HA、His、Flag、Myc、GFP等。HA标签系统利用一个HA (流感病毒血凝素,influenza hemagglutinin epitope: YPYDVPDYA)短肽融合到目标蛋白。HA标签可位于蛋白质的C端或N端,该系统已广泛应用于多种细胞类型,相应的HA标签抗体也被广泛应用。His标签其序列为六个组氨酸HHHHHH, 其特点是分子量小,基本不改变蛋白质的生物结构,因此也是应用蕞多的标签。Flag标签由8个氨基酸残基组成(DYKDDDDK),可以连接在目的蛋白的C端或N端,也广泛应用于多种细胞类型。Myc标签相当于人的c-Myc 410-419位肽段(序列为:EQKLISEEDL)。Myc标签可放在C端或N端,已成功应用于WB杂交技术、免疫沉淀IP和流式细胞术中。GFP(绿色萤光蛋白),是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质,从蓝光到紫外线都能使其激发,发出绿色萤光。GFP标签可位于蛋白质的C端或N端。通过对野生型荧光蛋白进行氨基酸突变和密码子优化,现eGFP/eCFP/eYFP/mCherry(增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白)等也被广泛应用。


HA、His、Flag、Myc、GFP等标签应用于ChIP-seq已经在动植物中都广泛被报道,那是否意味标签系统屡试不爽呢?其实也并不是,当我们将标签与目的蛋白进行融合表达时,存在着标签占据目的蛋白功能域从而影响目的蛋白发挥相应功能的可能,所以在实验中多推荐分子量较小的标签。另外,标签蛋白本身会结合DNA?若有,则会造成实验出现假阳性的结果,因此在实验中选择一个标签空载作为样本阴性对照是有必要的,包括在后期的EMSA验证中,也需要单独对标签是否结合探针进行验证。


除此之外,标签的应用必然牵扯到转基因,如何选取转基因受体材料也是至关重要的。当以野生型为受体进行转基因实验及后续ChIP时,内源性目的蛋白也会表达,这些内源目的蛋白会与标签融合蛋白竞争结合DNA,这必然导致利用标签抗体进行特异性富集时结果不完整甚至没有。因此,转基因的受体材料应选择目的蛋白缺失的突变体材料。另外一个需要注意的是,缺失突变体转基因后应进行后代的选育,保证标签和目的蛋白能够在后代中稳定的融合表达,这是因为T0代转基因材料因为其存在嵌合体状态,不建议以此为材料做后续的相关实验。


标签抗体系统并非想象中简单,需要对整体实验流程进行摸索。武汉爱基百客专注于表观遗传相关技术的研发与应用,已经摸索出一整套完整的ChIP-seq实验体系,并取得了良好的结果,下面展示部分结果。


GFP标签:

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Flag标签:


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Myc标签:

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Reads可视化可以看出有明显的基因组富集区域,peaks的分布也显示出主要集中在基因Promoter区,展示出了好的实验结果。


欢迎各位老师垂询,爱基百客将以饱满的热情、专业的服务,助力您的科研。


本文网址:http://www.igenebook.com/news/435.html

关键词:ChIP-seq,ChIP,EMSA

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