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ATAC-seq、scRNA-seq、ChIP-seq探究非淋巴组织调节性T细胞前体的产生机制

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ATAC-seq、scRNA-seq、ChIP-seq探究非淋巴组织调节性T细胞前体的产生机制

发布日期:2020-05-11 作者:爱基百客 点击:

       Foxp3调节性T细胞(Treg)是抑制自身反应和过度炎症的关键免疫细胞。在免疫失调、多发性内分泌病、肠道病和X-连锁综合征(IPEX)和坏疽小鼠中发现的致命性多器官自身炎症破坏都是是由转录调节因子Foxp3的突变引起的。Treg细胞调节多种免疫细胞的功能,从而影响多种疾病,包括癌症、自身免疫、过敏和传染病。近年来,越来越多的实验证明Treg细胞在非淋巴组织的稳态和再生中发挥了重要功能。包括内脏脂肪组织(VAT)、肌肉组织、肺组织、皮肤组织、中枢神经系统(CNS)中都有相应研究。双调蛋白(Areg)被认为有助于再生过程。

最近,组织来源的Treg细胞的DNA甲基化和转录数据表明,几乎所有非淋巴组织中都存在Treg细胞群,可通过白细胞介素33(IL-33)受体(ST2)和杀伤细胞凝集素样受体亚家族G1(Klrg1)的表达识别,并将细胞群命名为“tisTregST2”。 这种ST2阳性的组织Treg细胞群不仅容易表达Arge等组织再生因子,而且还表达Th2相关因子,包括高水平的Gata3、Maf和IL-10。ST2阳性Treg细胞的重要组织内稳态和再生功能已在不同的非淋巴组织中得到表征,包括VAT、CNS、肌肉和结肠。虽然从不同的组织中都有分离,但是来自VAT和皮肤的Treg细胞在其表观遗传重编程中显示出高度的重叠,表明在组织限制性特异化之前有一个共同的发育途径,但是其分子途径仍不清楚。

2020年2月18日发表于Immunity上的文章Precursors for Nonlymphoid-Tissue Treg Cells Reside in Secondary Lymphoid Organs and Are Programmed by the Transcription Factor BATF利用ATAC-seqscRNA-seqChIP-seq探究揭示非淋巴组织调节性T细胞前体的产生机制,并验证了转录因子BATF在其中的作用机制。


ChIP

结果展示

1、ATAC-seq探究不同组织Treg细胞群组织特异性特征和开放性模式

对稳态下tisTregST2细胞在不同组织中所占比例进行了探究(图1A),并通过ATAC-seq对不同组织来源的Treg细胞群进行了染色质开放性研究,并进行PCA聚类分析,发现tisTregST2群体与Tconv细胞、LN衍生记忆细胞和原始Treg细胞不一致。对多个样本进行染色质开放性比较,发现了核心”tisTregST2细胞特异性ATAC-seq峰(图1 E),通过对核心差异peak的motif分析,并鉴定到了bZIP、ETS、NF-κB、NRL和GATA等转录因子在其中发挥了重要功能。并且对组织特异性通路进行分析,说明不同组织tisTregST2显示出显著的“核心”组织特征以及组织特异性。


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2、脾脏Nfil3(GFP)阳性Treg细胞可能是向Klrg1+ST2+tisTregST2分化的前体细胞

根据之前的研究报道Nfil3在表观遗传调控中发挥了重要作用,并且核心”tisTregST2细胞特异性ATAC-seq峰中也鉴定到Nfil3核心结合序列(图2 A、B),因此作者猜测Nfil3可能有助于非淋巴组织Treg细胞分化的发生。因此作者构建了Nfil3(GFP))报告小鼠系,根据Nfil3(GFP)和Klrg1的表达,作者将Treg细胞分为三个群体,并对从脾脏分离的三个Treg群体进行UMAP(图2 F)和t-SN分析。每一分类子集的细胞都形成了相当均匀的群体,子集之间几乎没有重叠。所有亚群均表达Foxp3,但只有Klrg1+Nfil3(GFP)+Treg细胞显示Klrg1 mRNA表达(图2 G)。在从Klrg1-Nfil3(GFP)Treg经Klrg1-Nfil3(GFP)+Treg向Klrg1+Nfil3(GFP)+细胞的转化过程中,发现了几个关键的激活和分化基因。总的来说,这个结果表明脾脏Nfil3(GFP)阳性Treg细胞可能是向Klrg1+ST2+tisTregST2分化的前体细胞。

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3、scRNA-seq 探究脾脏和其他不同组织中Treg细胞的发育轨迹

作者对脾脏、腹股沟LN、BM、血液、VAT、皮肤、肺和肝脏中分离出CD4+CD44+CD25+Foxp3(GFP)+记忆Treg细胞,并进行了scRNA-seq。结果发现来自肺、VAT和皮肤的组织分离的记忆Treg细胞与两个脾脏来源的Nfil3(GFP)+ Treg记忆细胞亚群之间几乎没有重叠,只有少数来自前体的细胞位于不同的组织中,这表明只有极少量的Treg细胞存在多个组织中。

随后作者对来自脾脏的三个亚群细胞、皮肤、结肠和VAT的tisTregST2进行TCR的α和β链进行单细胞测序和克隆相关性分析,根据单细胞轨迹和TCR分析,结果表明脾脏Klrg1-Nfil3(GFP)+细胞通过Klrg1+Nfil3(GFP)+Treg细胞顺序分化为tisTregST2细胞。


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4、RNA速度分析揭示tisTregST2前体的继承性转移和发育动力学

作者在对scRNA-seq数据进行RNA速度分析时发现了从Klrg1-Nfil3(GFP)–经由Klrg1-Nfil3(GFP)+到Klrg1+Nfil3(GFP)+的顺序分化(图4A)。为了进一步验证这一点,作者使用荧光激活细胞分类(FACS)-纯化的Klrg1-Nfil3(GFP)和Klrg1-Nfil3(GFP)+Treg亚群注入去Treg同源(CD45.1)Foxp3DTR宿主小鼠(图4B和S4A)进行过继转移实验。根据RNA速度、转移实验和出生后的发育动力学研究,脾脏Klrg1-Nfil3(GFP)+通过Klrg1+Nfil3(GFP)+前体细胞分化为组织常驻的Klrg1+Nfil3(GFP)+tisTregST2细胞。


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5、ATAC-seq探究Nfil3(GFP)+tisTregST2前体细胞的基因调控模式

为了剖析定义tisTregST2前体的分子程序,作者从脾脏中分离出Klrg1-Nfil3(GFP)、Klrg1-Nfil3(GFP)和Klrg1+Nfil3(GFP)+Treg细胞,并进行ATAC-seq实验。通过两个样本之间的成对比较,得到了11330个差异Peak,并对差异Peak进一步分析。作者发现脾脏Klrg1-Nfil3(GFP)+和Klrg1+Nfil3(GFP)+tisTregST2前体中tisTregST2细胞特异区域的染色质开放性逐步增加。


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6、BATF与Nfil3(GFP)+tisTregST2前体发育有关

作者利用ATAC-seq得到的Klrg1-Nfil3(GFP)-Treg和Klrg1-Nfil3(GFP)+或Klrg1+Nfil3(GFP)+Treg细胞之间差异染色质开放区域,并确定其中BATF是高度富集的转录因子(图6A)。为此,作者对BATF motif区域内ATAC-seq的测序进行可视化观察(图6 B)。通过对已发表的CD4+和CD8+T细胞BATF ChIP seq数据重新分析,作者注意到BATF ChIP-seq结果与ATAC-seq峰高度重叠(图6C),这表明BATF可能在tisTregST2前体发生起到了重要作用。作者证实了脾脏的Klrg1-Nfil3(GFP)+Treg和Klrg1+Nfil3(GFP)+Treg细胞中的Batf表达升高(图6E)。通过scRNA-seq数据找到了众多BATF相关基因。随后通过构建BATF 缺失材料证明,BATF是一个关键的转录因子,它通过驱动分子前体程序来促进tisTregST2前体的发育,如果缺失,则会导致前体细胞分化不足,从而导致非淋巴组织中没有成熟的tisTregST2细胞。



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       小结:

       本实验借助scRNA-seq测序分析,揭示了非淋巴组织调节性T细胞前体的产生机制,并且结合ATAC-seq、ChIP-seq,寻找其中关键的转录因子BATF,并对其作用机制进行了挖掘。单细胞测序技术发展如火如荼的今天,该技术已经广泛应用于细胞分化、疾病发生等重要的生命过程,在此基因上,借助其他技术手段,对其中机理进一步探究也必定是今后研究发展的主要方向。另外,除了scRNA-seq之外,scATAC-seq也是当今热门的研究手段,本文中,是否可以利用scATAC-seq进一步对研究结果进行验证并挖掘更多有用信息呢?这也许是作者给我们留下的一个思考方向。

       IP类产品:ChIP-seq,DAP-seq,CLIP-seqRIP-seq,DRIP-seq,6mA-IPseq,MeRIP-seq,IP,Co-IP

       测序产品:WGBS,ATAC-seq,WGS,RAD/GBS,smallRNA,LncRNA,转录组,精准转录组,全转录组,降解组

       分子产品:EMSA,Y1H,Y2H,分子标记,荧光定量,载体构建

       新星产品:ScWGBS,ScATAC,ScRNA-seq,CUT&RUN,CUT&Tag

       其他产品:代谢组,修饰酶组


本文网址:http://www.igenebook.com/news/521.html

关键词:ChIP,ATAC,单细胞

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