单细胞转录组技术进展

发布日期：2020-11-13 作者：点击：

　　单细胞转录组领域这几年的发展突飞猛进，我们从2015年同一期的两篇cell开始然后再加上2016年的nature communication。第一篇cell名叫Drop-seq，其过程和原理如图1所示，首先就是给一个bead表面合成无数含有polyT的反转录引物（一个磁珠上含有的polyT引物数量可以高达10的8次方个），然后将每一个磁珠和一个单细胞通过微流控技术放到同一个油包水液滴中进行细胞裂解和逆转录，然后回收所有液滴中的cDNA进行PCR建库、测序及下游分析。

　　单细胞转录组

　　通过以上的介绍相信大家对于Drop-seq这个技术存在疑惑，是如何区分不同的细胞以及同一细胞中同一基因的不同转录本D的呢，答案就在于barcoding技术之中。首先在bead的合成设计中就包含了区分不同细胞和转录本的DNA barcode序列（图2），不同细胞barcode合成的过程就是每一步分四个反应进行，每个反应只添加一个确定的碱基，当前一步完成进入下一步之前，将所有beads混合后均分为四份，然后分别进入下一轮不同碱基的添加反应。如此经过12个循环之后理论上就可以合成4的12次方（16,777,216）个不同的beads，每个bead所带有所有cell barcode都是一致的。然后就是在合成polyT引物之前给所有beads上的引物序列进行八轮碱基添加反应，每一轮随机添加四种不同的碱基，这样每一个磁珠上就会有好多（4的8次方=65536）不同的引物，这些引物足以区分同一基因的不同转录本。至此，可以大批量做单细胞转录组测序的Drop-seq技术横空出世。

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　　我们发现还有另外一篇文章也是用的类似的思路，它们都是借助微流控平台，其好处就是小珠子内部的引物是可以通过UV催化断裂然后分散到溶液中，更有利于对转录本的捕捉，所以对单细胞中的RNA捕捉效率更高（图3）。其逆转录引物的合成过程可就复杂多了，但是逻辑上都要得到区分不同细胞和同一基因不同转录本的目的，感兴趣的读者可以自行研读参考文献 2。

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