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干实验系列|单细胞转录组在胰腺癌中的应用

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干实验系列|单细胞转录组在胰腺癌中的应用

发布日期:2020-11-17 作者:成慧 点击:

单细胞技术在临床应用上十分广泛,除了了解单细胞层面的遗传信息,还能为一些目前临床治疗十分棘手的疾病提供治疗依据和治疗思路,对于一些特别疑难的疾病,也能提供“早发现”的精准检测。

本文介绍了单细胞转录组在胰腺癌中的应用。

胰腺癌是发生于胰腺外分泌腺的恶性肿瘤。胰腺恶性肿瘤可来自胰腺外分泌腺、内分泌腺或非上皮组织,其中95%为胰腺癌,该疾病预后最差,其发病率和死亡率很高。主要是使用药物、手术、放化疗等方法治疗疾病。

胰腺导管腺癌(PDAC)是最常见的胰腺癌,大多数患者最终将因癌细胞转移而死亡,并且当今缺乏PDAC疾病的有效治疗方式。其肿瘤异质性高且难以预测。“Single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma”这篇文章于2019年6月在cell research上表明,影响因子20.507。文章利用scRNA-seq研究揭示了肿瘤前期发展过程中上皮细胞,免疫细胞和成纤维细胞内的途径改变,并发现了早期发病机理的几种生物标志物,这为抗癌治疗(例如靶向治疗和免疫治疗)提供了潜在的生物标记。

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研究材料

3例非胰腺肿瘤患者(如胆管肿瘤或十二指肠肿瘤)和8例非恶性胰腺肿瘤患者

研究手段

scRNA-seq(生信分析:t-SNE聚类分析、marker鉴定、CNV分析、拟时序分析、转录因子分析、TCGA分析)

IHC染色

研究结果

1、PDAC肿瘤及对照样品的单细胞表达图谱和细胞分型

为了探索PDAC中的细胞多样性,作者通过24个PDAC肿瘤样品和11个胰腺中未经任何处理的对照样品生成了单细胞RNA-seq图谱。作者从PDAC样品中获得了41,986个细胞,从对照胰腺中获得了15,544个细胞。作者对所有细胞中可变表达的基因进行了主成分分析,并确定了10个主要簇,包括1型导管,2型导管,腺泡,内分泌,内皮细胞,成纤维细胞,星状,巨噬细胞,T和B细胞。然后,作者通过进行差异基因表达分析来定义每个细胞簇的身份,从而生成簇特异性标记基因。作者使用细胞类型标记物确定了PDAC中存在两种不同类型的导管细胞。两种类型的导管细胞均显示高水平的导管标记:38、39 MMP7,TSPAN8,SOX9和LCN2。然而,预测不良的PDAC标记物的2型细胞表达较高,表明2型细胞可能是恶性导管细胞的一种。作者进一步比较了来自11个非肿瘤控制胰腺的15,544个细胞的scRNA-seq图谱,在对照样品中未检测到2型导管细胞。相反,在PDAC样品中,2型导管细胞比1型导管(11,315 / 2,646)增长4.3倍,这表明2型导管细胞在PDAC中显着扩展。

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2、CNV landscape区分PDAC中的恶性导管细胞

为了定义恶性细胞,作者基于基因组区间的平均表达模式,计算了每种细胞类型的染色体拷贝数变异(CNV)。结果发现2型导管细胞的CNV水平显着高于1型导管细胞以及其他类型的细胞。相反,对照样品中的细胞显示出较低的CNV分数。

然后,作者比较了PDAC和对照胰腺之间的1型导管细胞,并鉴定了1296个上调的基因和183个下调的基因。进一步发现这些上调的基因中的1102/1296在2型导管细胞中也高度表达,表明这些基因的失调在PDAC的1型导管细胞中发生。功能分析表明,PDAC的1型导管细胞中的上调基因在炎症反应,细胞粘附和迁移等多种疾病均显着富集,这表明相对于对照组,PDAC中的1型导管细胞代表异常状态。

接下来,作者检查了PDAC中两种类型的导管细胞的基因表达模式,并鉴定了3107个差异表达的基因。功能富集分析表明,在2型细胞中上调的基因主要富集与癌症相关的功能,例如细胞增殖,迁移和缺氧,进一步支持该亚型的恶性状态。相反,在1型细胞中表达高于2型细胞的基因与正常的胰腺功能有关,包括消化,胰腺分泌和碳酸氢盐转运,这表明1型细胞仍然具有一定程度的导管细胞功能。与恶性2型细胞相比。作者还鉴定了多种标记物,例如AMBP和MUC1,可用于区分导管细胞的异常和恶性基因表达谱。然后,作者在PDAC和对照样品中进行了标记(MUC1,FXYD3用于2型导管细胞和AMBP用于1型导管细胞)的标记的免疫组织化学(IHC)染色,以验证这两种类型的导管细胞。作者观察到AMBP阳性细胞主要存在于具有正常细胞特征的导管结构中。相反,MUC1或FXYD3阳性细胞表现出典型的肿瘤细胞特征,而在对照样品中则不存在。综上所述,这些结果表明2型导管细胞是PDAC中恶性细胞的主要来源。

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3、恶性导管细胞中的不同亚组

作者根据t-SNE分析将2型导管细胞进一步分为7个亚组。 通过比较基因表达水平,发现每个亚组都表达了特定基因集。 值得注意的是,作者发现在大多数患者中亚组3细胞占据主要比例,这表明该亚组在PDAC患者之间是共有的。 相反,仅在某些患者中观察到亚组1、2、4、5和6,这反映了各个患者的肿瘤异质性。 此外,作者注意到在16/24患者中通常观察到导管2恶性细胞中比例较低的7亚组细胞。

由于增殖是PDAC的主要特征,因此作者对每个亚组进行了功能富集分析,发现亚组7的独特功能与细胞周期和细胞增殖有关,并发现增殖标志物MKI67,TOP2A和细胞周期标志物CCNB1和CCNB2特异性表达。

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4、根据恶性导管标志物对TCGA PAAD样品中的基因表达模式分析

接下来,作者分析了来自TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)的公共浸润性胰腺导管腺癌及其变体(PAAD)数据,以研究恶性导管细胞中基因表达模式的临床价值,包括癌症表达数据,临床信息和基因组突变数据。总共使用了178个PAAD样本(146个PDAC样本,32个非PDAC PAAD样本)进行了分析。基于恶性导管细胞标志物,将所有样本分配给三个PDAC组(第1-3组)和一个非PDAC组(第4组)。结果显示,恶性导管标志物可以有效地区分PDAC患者和其他类型的胰腺癌患者。

然后,作者探讨了增生性导管标志物在PDAC患者中的预测价值。作者使用NNMF聚类,并根据增殖标记物的表达水平将PDAC患者分为3个亚组。作者发现,与其他组相比,第3组的患者显示出大量的增生性导管标志物,并且生存率显着降低。这些结果表明具有阳性增殖标志物的导管细胞与PDAC结果密切相关。

接下来,作者比较了第3组和其他两组之间的TCGA转录组数据,以确定差异表达基因,在第3组患者中检测到759个上调基因和946个下调基因(p.adj≤0.01和| log 2 FoldChange | ≥0.5)。GO功能富集分析表明,在诸如细胞周期,DNA复制和DNA修复等GO term方面富集的基因高度上调,而在T细胞选择和淋巴细胞活化方面则主要被下调的基因富集。然后,作者在单细胞数据中分析了上述差异表达基因的表达模式。作者发现大多数基因在某些特定细胞类型中高度表达。具体而言,许多上调的基因在2型导管细胞中表达,而下调的基因主要存在于巨噬细胞和T细胞中,这表明TME中导管增殖的失调和免疫反应同时发生

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5、具有丰富的高增殖性导管标记物PDAC患者的T细胞失活

为了评估PDAC中T细胞的功能,作者使用TCGA数据分析了PDAC基质中T细胞的活化状态。作者观察到,具有高水平增殖导管标记物的样品反之具有较低的T细胞标记物表达水平(图5d)。此外,在作者的PDAC单细胞测序数据中也检测到这种反比关系(补充信息,图S5a)。然后作者计算了CD8 T细胞活化评分,发现增殖性导管细胞高的组的T细胞活化评分明显较低(P值= 0.0081,图5e)。为了验证这一发现,作者对Ki67和CD3D进行了免疫共免疫通过IHC对10个PDAC组织进行研究,以研究导管细胞的增殖状态与T细胞浸润之间的关系。结果发现,增生性导管细胞的存在和T细胞活化的丧失都可能导致PDAC患者的预后不良。

先前的TCGA大量RNA-seq分析报告了PDAC样品的四种亚型:鳞状,胰腺祖细胞,免疫原性和异常分化的内分泌外分泌(ADEX)。作者使用从TCGA四种亚型患者中识别出的特征基因来计算在单细胞图谱中发现的每种细胞类型的占比。祖细胞和ADEX亚型在2型导管细胞和腺泡细胞中均显示较高的占比,而免疫原性亚型在T和B细胞中均显示较高的占比。值得注意的是,鳞状亚型在2型导管细胞,内皮细胞和星状细胞中占比相对较高,而在T和B细胞中占比较低,表明在肿瘤微环境中存在复杂的免疫反应。

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6、PDAC中免疫细胞和成纤维细胞的不同亚型

最近的研究表明,基质细胞(例如T细胞,巨噬细胞和成纤维细胞)具有高度异质性,但是,这种异质性在PDAC中的程度仍然很差。作者对T细胞,B细胞,巨噬细胞和成纤维细胞进行了亚簇化,并分别在这些细胞类型中检测到了5、6、5和8个子集。对于T细胞,已知标志物的表达有两个CD8+细胞簇和三个CD4 +细胞簇。

为了描述肿瘤微环境中巨噬细胞的多样性,作者选择了具有已知髓样标记CD68和FCER1G的细胞,并鉴定了五个细胞簇。作者发现,与II类抗原有关的基因(HLA和CD74)在簇1中有较高的表达水平。相反,与细胞外基质(ECM)沉积和重塑(COL1A)相关的基因在簇2中优先表达。作者注意到CCL2作为MDSC迁移的主要趋化因子基因在簇3中较高,而簇5专用于生成促炎细胞因子(S100A8和S100A9)。与募集骨髓细胞相反,簇4表达负责细胞毒性T细胞(例如CXCL9和CXCL10)浸润的趋化因子基因水平更高。

此外,作者对T细胞中的子集进行了伪时间分析,并揭示了从幼稚T细胞和记忆T细胞到调节性T细胞的转变。同样,从原始B细胞的起点到成浆细胞的B细胞种群轨迹是有序的。


研究结论

该文章研究进一步确定了影响几种已知癌变途径并抑制了与临床病理特征相关的肿瘤相关T细胞活化的新型基因表达变化。因此,本文的研究将改善我们对PDAC进展机制的了解,并且在为PDAC提供新的预后标志物方面可能有价值


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