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10x Genomics|空间转录组助力阿兹海默症研究

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10x Genomics|空间转录组助力阿兹海默症研究

发布日期:2020-11-25 作者:程伟 点击:

1960年科学家发现阿尔兹海默氏病的痴呆程度与斑块和神经纠结程度有关,之后,科学家们又发现阿尔兹海默氏病患者的大脑中存在称为amyloidβ淀粉样蛋白,这种淀粉样的蛋白斑块由一些错误折叠的蛋白组成,之后,科学界在β淀粉样蛋白和阿尔兹海默病之间建立了联系。

但是到目前为止,这种淀粉样斑块的特征的分子变化和细胞互作了解的并不是特别情况,2020年8月发表在cell杂志(IF=38.637)上的Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer’s Disease利用空间转录组和原位测序来探究淀粉样斑块周围基因的空间基因变化信息,以期通过了解基因变化,以解开在阿尔兹海默氏病和其他脑疾病的致病特征附近的失调的细胞网络。

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研究背景

虽然阿尔茨海默病(AD)的淀粉样斑块周围观察到复杂的炎性样改变,但这种反应特征的分子变化和细胞相互作用尚不清楚。

研究材料

小鼠WT(C57BL/6)(3.5月、6月、12月和18月)、AD(AppNL-G-F)(3.5月、6月、12月和18月)左脑右脑分别OCT包埋后冷冻切片

人(3例AD病人,3例NDC正常人)

研究方法

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研究结果

1、IHC染色检测Aβ在脑组织切片中的表达情况,用每个TD中的Aβ的荧光强度来表征Aβ指数,指示Aβ从背侧向腹皮层、丘脑和海马体变化进程。为研究WT(C57BL/6)样本和AD(AppNL-G-F)样本的基因表达变化情况,进行两次差异表达分析,构建基因型模型和Aβ模型。RNAscope检测发现18月龄小鼠AD 样本6个基因的表达明显下调(Cst7Cd68C1qaSlc1a3CluMbp)。将淀粉样斑周围的细胞分成5个同心环,环1的Aβ强度Z强,环5的Aβ强度Z弱。通过比较空间转录组和RNAscope的检测到得每个Aβ靶点的表达情况,发现空间转录组和RNAscope的结果一致(皮尔斯系数=0.92)。两组模型构建得到了基因型和Aβ与年龄相关的基因表达改变信息。抗原加工、趋化效应、溶酶体降解和炎症反应在18月龄时沿Aβ轴和基因型轴上调,但是髓鞘类别在3月龄时上升,18月龄时下降,而且是沿Aβ轴而不是基因型轴。对获得的10327个转录本谱进行WGCNA分析,鉴定出12个模块。

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图:检测Aβ在脑组织部位的分布情况


2、WGCNA分析得到的模块中,PIGs模块(plaque-induced genes)在18月龄时在基因型和Aβ轴中Z具反应性。该模块包含57个基因,Z初轻微上调,但是在6-12月龄间显著上调。作者发现,PIG表达与Aβ积累保持一致。GO分析显示该模块参与了经典补体级联以及补体级联触发的效应机制如内吞作用、溶酶体降解、抗原加工和传递、免疫应答和氧化还原过程。

作者调查发现PIG模块与反应性小胶质细胞和炎症性星形胶质细胞强烈相关。在PIGs中,有5个PIGs与A1星形细胞标记重叠,有18个PIGs与DAM/ARM小胶质细胞基因重叠。有36个PIGs之前没有被定义为与疾病相关的神经胶质基因。10个Z有关联的hub genes(CtsdC4bCst3ApoeC4aGfapTyrobpLyz2Trem2以及B2m)与激活的小胶质细胞和星形胶质细胞有关。作者评估在小鼠中发现的PIGs是否可以在人类数据集中被识别。在41个细胞间亚群中,PIGs与AD相关的小胶质特征联系Z紧密。在Aβ暴露或基因型作用下,将与小鼠同源基因的人类Mic1标记基因表达变化重点标记。对小鼠的分析表明,人脑中的Mic1反应是对淀粉样蛋白斑块的更大的多细胞协调反应的一部分,而且这种反应会随着时间的推移而演变。

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图:PIGs鉴定


3、in situ测序检测两个WT和AD18月龄鼠(探针:针对小胶质神经病ItgamCx3cr1Csf1r;针对星形胶质细胞的Slc1a3GfapClu;针对神经细胞的Syp以及针对少突胶质细胞的Plp1)。54个PIGs中,有51个PIGs在ring 1种显著性富集,而C1qb显著性缺失。这个结果与空间转录组的结果一致。分析不同的基因在不同的细胞中的表达量,并且用RNAscope来验证结果,发现,RNAscope和ISS测序结果表明18月龄的AD小鼠C1qaitgam阳性的细胞(小胶质细胞)中表达,slc1a3阳性的细胞(星形胶质细胞)表达Clu,而C4在mbp阳性的细胞(少突胶质细胞)中表达——都靠近淀粉样斑块。

对PIGs进行WGCNA分析,根据Aβ指数将空间转录组的关于AD的TDs分为WT和4分位数,做Circos图。在Circos图中,PIGs被分为3个集群(绿色、蓝色和橙色)。WT中,橙色PIGs之间没有或几乎没有联系。在AD鼠中,随着Aβ指数的增加,PIGs之间的连通性在三个集群内和集群间得到加强。在Q4中,共表达总体很弱。在Q3中,蓝色和橙色簇中的几对基因强烈共表达。在Q2甚至Q1中,三个集群之间有强大的联系。Z强的连接在Ctsd(绿色)和C1qaC1qbCtsbCtssHexb(蓝色)之间,或者在Apoe(绿色)和C1qb(蓝色)之间。橙色和其他两个簇之间Z强的连接从Trem2Tyrobp(橙色)到CtsdB2mApoe(绿色),再到C1qaC1qbHexbCtss(蓝色)。

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图:ISS鉴定的PIGs以及PIGs的WGCNA分析


4、ST测序后的WGCNA分析中,差别排名第二的模块主要由少突细胞表达的165个基因组成,称为“OLIG模块”。OLIG模块前十名的核心基因为髓鞘相关转录本:Plp1MbpMobpCldn11MalApodCnpTrfFth1Plekhb1。将OLIG与已发表的小鼠单细胞数据库进行比较,证实与少突胶质细胞密切相关,轻度关联激活型小胶质细胞。OLIG与人类AD相关的少突胶质细胞密切相关。我们突出显示了20个人类Oli0 marker基因的小鼠直系同源基因。几个Oli0直系同源基因与OLIG模块一起上调或下调。

与WT小鼠相比,在3月龄和18月龄的AD小鼠中,OLIG模块在基因型轴和全脑范围内整体上调。作者从基因型中分离Aβ暴露(Aβ轴)的影响时,可以观察到OLIG模块表达的一个有趣变化:3月龄时整体呈正相关,18月龄时为负相关。在不同的大脑区域,这种反应也有明显的差异:OLIG表达的主要驱动因素不是Aβ指数,而是大脑区域本身。在3月龄时,在纤维束(FB)、丘脑(TH)和下丘脑(HY)中发现OLIG-Aβ显著正相关,而在内嗅皮层(ENTI)和海马体的一些皮层中发现OLIG-Aβ显著负相关。在18月龄时,听觉区域(AUDs) OLIG-Aβ显著负相关,而在ENTI和海马体中OLIG-Aβ显著正相关。

更详细的分析Aβ指数和OLIG表达之间的关系,发现Aβ的沉积在不同区域表现不同。对3月龄AD小鼠进行RNAscope(针对OLIGs的4个探针Plp1MbpOlig2Cnp)实验表明,4个OLIGs在致密淀粉样斑块周围表达显著减少。

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图:OLIG模块对Aβ积累的时空响应


5、从3名AD患者和3名非精神错乱的对照组中获得了死后的人脑样本。作者调查了与AD相关的额上回组织进行了分析,发现了22个基因表达谱:其中45个人PIGs直系同源基因、42个OLIG模块中的斑块反应基因的直系同源基因以及一系列细胞类型marker。PIG模块和OLIG模块基因在灰质和白质中分别被富集。ISS检测对照组和AD组的人PIG直系同源基因的分布,发现大多数PIGs的表达的细胞类型在AD和对照组中一致。与小鼠中一样,人的PIG模块的3个亚模块在对照组中通过星形胶质细胞和小胶质细胞表达。然而,作者还发现9个PIGs(LGMNHEXBHEXACTSBCTSAGNSGPX4CTSDITM2B)在神经元富集,而2个PIGs(LGALS3BPCD9)在少突胶质细胞富集。PLEKCYBALAPTM5在小鼠的少突胶质细胞中显著富集,而在人类的小胶质细胞中显著富集。作者Z终确认在45个可检测的PIGs中,只有18个在淀粉样斑块细胞生态位中显著富集,包括9个小胶质PIGs(C1QAC1QBC1QCTYROBPLY86CYBAFCGR2OLFML3LAPTM5),5个星形胶质PIGs(GFAPCLUCTSHCST3IGFBP5), 和在多种细胞类型中表达的5个PIGs(CTSHGRNLYZHEXBAXL)。有趣的是,我们发现APOEARPC1B在AD患者的小胶质细胞中表达显著,而NPC2S100A6ITGB5PRDX6VSIR在AD患者星形胶质细胞中表达显著,而在对照组中没有,提示AD患者疾病相关的胶质细胞激活。

从OLIG模块中差异表达基因的顶级排列中选择的42个人类直系同源基因的细胞特征。淀粉样斑块细胞生态位中有22个基因显著缺失(CRYABANLNSLC44A1PLP1ARRDC3EFHD1ITGB4FNBP1FA2HAPODTTYH2PDE8APLLPTMEM63APHLDB1MOGASPATFTPPP3ERMNPPP1R14AMOBP)。5个基因在淀粉样斑块细胞生态位中显著增高表达(WSCD1MBPPLEKHB1KIAA0930BCAS1)。大部分OLIG模块中的人类直系同源基因在对照组和AD患者少突胶质细胞中富集,除了神经元中(KIAA0930)、氧化还原传感器(NMRAL1),以及星形胶质细胞中蛋白质聚合调控者(CRYAΒGSN)、细胞迁移/粘附分子(TPPP3ITGB4)和肌酸催化剂(GATM)。有趣的是,通常由少突胶质细胞表达的APOD——一种主要在大脑中表达并在AD中上调的脂蛋白编码基因,也在AD患者的小胶质细胞中显著富集,但在对照组中没有。

对比人体实验和小鼠实验发现,小鼠中的复杂情况比人体小。在鼠中,只有淀粉样斑块诱导的病理进行了研究,然而,AD的后期阶段,Tau蛋白、坏死性凋亡等等对病理的额外贡献导致病理情况变得复杂,并没有出现在小鼠模型中。事实上,小鼠模型的病理被认为反映了疾病的早期阶段。从人类大脑中淀粉样斑块和神经元缠结的出现到患者的Z终痴呆,可能长达20年。因此,自人类淀粉样病理开始,许多额外的变化将发生,然而,在小鼠的PIGs和OLIG模块中发现的许多基因在AD晚期显示出显著的变化。

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图:ISS检测人脑中PIG和OLIG模块表达情况


研究结论

在小鼠模型中,淀粉样斑块周围100毫米直径的组织区域内发生转录变化

在阿尔茨海默氏病(AD)小鼠模型中,研究使用空间转录组学在淀粉样斑块周围直径100μm的组织域中检测了转录变化。研究证明了丰富的髓鞘和少突胶质细胞基因(OLIG)共表达网络的早期改变,而斑块诱导基因(PIG)的多细胞基因共表达网络涉及补体系统、氧化应激、溶酶体和炎症,这些在疾病后期尤为突出。

研究使用小鼠和人脑切片上的原位测序证实了在细胞水平上观察到的大多数变化。全基因组空间转录组学分析提供了一种前所未有的方法,来解开AD和其他脑部疾病的致病标志附近细胞网络失调。

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