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聊聊单细胞实验哪些事

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聊聊单细胞实验哪些事

发布日期:2021-07-30 作者: 点击:


自10x Genomics公司推出chromium单细胞捕获平台以来,单细胞技术的应用突飞猛进。各国的科研人员都体验到了大批量单细胞捕获技术的优势,纷纷投入单细胞天地,体会单细胞技术在科技领域的魅力。

当然了,单细胞技术的应用最初或者说直到今天,也是在医学领域应用最为广泛。它在医学的各个领域如免疫学、医药应用或者神经学等方方面面发光发热。农学中的畜牧领域也有较为广泛的涉猎,如猪、牛、羊等常见或其他不常见的动物都能找到较多的单细胞相关文章的发表,但是在植物领域却应用较晚且能搜索到的文章较少。植物应用受限的原因在与细胞壁。较厚的细胞壁屏障在植物疾病防御或者是逆境胁迫过程中起到了重要的保护作用,但是这种保护作用在单细胞技术应用上却成为了拦路虎。值得高兴的是,随着单细胞技术的广泛应用,大量研究报道表明单细胞转录组与单核转录组的最终结果差异不大,这也给植物的单细胞技术应用点亮了明灯。单核转录组在植物领域越来越受欢迎,也越来越多植物相关研究者加入了单细胞阵营。在技术应用的同时,对于单细胞技术的质控方面,我们有必要仔细进行讲解。

关于单细胞悬液制备的质控,相信所有的老师都清楚明白,我们获得的悬液中,如果是单细胞悬液,需要细胞活性85%以上,无大于40 μm上的细胞碎片(关于碎片这块,我们要尽量保证碎片尽可能的少,因为虽然小于40 μm的碎片不影响单细胞捕获,但是影响后续的反转录建库),如果是单核悬液,我们需要保证细胞核的完整性,并且活细胞率要小于5%,同时也需要保证无大于40 μm以上的细胞碎片。

细胞(核)悬液进行10xGenomics的chromium平台的单细胞捕获实验后,后续的质控就是捕获实验完成后,油包水的乳浊液是否分层、破油是否充分以及cDNA的浓度和片段分布是否合理。

以上实验的顺利进行后,就到了分析步骤了(什么,建库、测序质控,哎呀啦,这写步骤不属于单细胞实验特有,其他只有涉及二代建库测序项目,都需要满足的条件,我们就不在此说明啦)。

说到上机测序,有一点需要强调的就是,10x单细胞文库与我们常见的文库不太一样,测序策略需要有所调整,进行测序前,我们需要与测序公司仔细沟通,提前说明测序的文库是单细胞文库,并且是哪种单细胞文库类型,这样就不会出现测序数据不能用的情况啦。

好啦,回到测序后分析的质控话题上来。10x单细胞数据分析的质控,我们常常会经过cellranger后,得到一个网页版的质控文件,上一个页面也大家看看吧,相信大家应该都看的比较多了。


11.png

看到这样的图形界面,我们要怎么来判断结果的好坏呢?

首先,预期的捕获数目与我们的实际捕获数目是否有出入(Estimated Number of Cells)。

然后就来看看数据的测序量Mean Reads per Cell,它反应了单个细胞的测序量。我们知道,10x官方推荐每个细胞的测序量至少要达到20 K reads/cell,如果达不到,表明测序量不够。

另外一个质控点就是Median Genes per Cell,基因的中位数,这个数目能反应细胞的整体捕获基因情况,10x官方认为该质控上数目大于200即可,但是对于大多数样本来说,需要至少大于500才行,当然,也有一些特殊样本有很多低表达的细胞,这种情况的话,需要针对后续的分群结果图来看属于低表达的细胞类型是哪些,翻阅文献来判断这些细胞类型是否真实等。

还有一个质控点就是Fraction Reads in cells,一般如果样本中游离的mRNA较多,该数值就会较低,常规大约70%即可,如果达不到,我们需要看看样本制备时的样本情况了。

除了这些质控点需要关注外,我们看到还有很多其他的质控,一般来说,我们关注以上质控点就行,其他的点出现报错的几率较小。

当然了,除了以上文字质控外,我们还有一个图形质控Barcode Rank Plot。在这里,好的质控结果中,cells和background能够较好的区分,并且出现明显的拐点。拐点的数目以及对应的横坐标数都有要求,见下图:


11.png

较好的结果就像上图所示,cells上出现一个明显的拐点,background出现一个明显的拐点。

也有cells上出现两个或以上拐点数的结果,此时就需要针对具体情况具体分析啦。

11.png

中间拐点处一般有一些低表达的细胞或者处于凋亡的细胞或者是杂质等,需要根据具体情况具体分析,如在分群分析时,UMI counts数低的细胞类型是否是正常的细胞类型、是否有凋亡相关基因表达、是否有线粒体基因表达等等。

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像这样类型的图,那不必看了,实验确定失败,就自行重新实验吧。

说了,这么多,不知道大家对于10x单细胞实验质控有没有了解清楚呢?

爱基百客生物拥有广泛的医学、农学相关单细胞实验经验,有需要10x单细胞技术服务的老师,可以与我们联系。当然了,也欢迎各位老师与我们进行10x技术讨论,无论哪种需求,能促进单细胞技术的发展,是我们一致的目标,在达到这个目标的道路上,我们都在不懈努力中。


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关键词:10x,10xGenomics,单细胞实验

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