您好!欢迎来到武汉爱基百客生物科技有限公司的官方网站!

表观组学技术服务

新闻分类

产品分类

热门关键词

联系我们

武汉爱基百客生物科技有限公司

电话:027-87606602(市场部)  

          027-62431231(行政部)

Q Q : 270105245   465436937   

         1511879086   812115916

传真:027-87606602

邮箱:support@igenebook.com

地址:武汉市东湖高新区高新大道888号高农生物园高农国际1栋  

网址:www.igenebook.com


ChIP话题|ChIP之IP实验详解

您的当前位置: 首 页 >> 新闻中心 >> 技术知识

ChIP话题|ChIP之IP实验详解

发布日期:2021-08-10 作者:程伟 点击:

ChIP-seq/qPCR实验我们经常在文章里看到,作为表观技术的中流砥柱,ChIP也深得表观研究者的心,这么重要的实验,相信很多老师都会进行尝试,但是大部分老师对于新的实验技术都是借鉴参考文献的步骤,这里呢,爱基百客生物拥有了5000+的实验经验,给大家分享下ChIP中的注意要点。


ChIP实验中,IP非常重要并且有一定技术含量的步骤,在这步骤中,涉及到一些关键点我们来一一解说。

图形2.jpg

01
input、IP、IgG

我们经常看到文章里有input出现,那么input是什么用来做什么的呢?这里,我们来详细聊聊它吧。Input实际上就是我们要IP的溶液中取部分出来进行纯化和建库,取出来的溶液我们称为input,它本质上就是一个常规的DNA文库,我们的重测序文库类似,但是后续分析时作用不同。在整个ChIP实验过程中,input在IP-WB后续ChIP-qPCR中,作为阳性对照在ChIP实验的后续生信分析过程中,是作为背景的,分析流程中,我们需要将IP建库得到的reads去除该位点上input的reads影响,后续我们也会进行详解,这里就不多说了到ChIP-qPCR,我们要重点强调一点,ChIP-qPCR中,大家会关注%input这时候需要详细记录好input取样时总体容积的比例了,比如1000 ml中取20 μl作为input,那么计算%inputIDFInput Dilution Factor)就是50。


IP就不用解释了吧,就是我们用目的蛋白对应的抗体进行抗体-抗原免疫反应,最后将目的蛋白互作的DNA富集后纯化建库,也就是整个ChIP实验中的核心-免疫共沉淀实验了。


IgG用来干什么呢?IgG通常作为我们目的蛋白的阴性对照来进行实验的(此处强调一波:IgG是一抗,大家不要搞混了理论上IgG是不能特异性富集任何的DNA片段。所以如果我们后续需要做seq的话,是不建议做IgG,因为后期建库一定会失败不要问我为什么,不然IgG知道了肯定要跳出来说一句:没有DNA,拿什么建库呢)那么是都不用做么?这个也不是,在ChIP-qPCR中,关键点是需要计算出样本的富集倍率,这个时候就是IgG发挥作用的时候了,我们需要将IP产物的CT值来相对阴性组IgG的CT值来计算富集倍率上一波ChIP-qPCR的计算公式吧:

ΔCt [normalized ChIP] = (Ct [ChIP] - (Ct [Input] -Log2 (Input Dilution Factor)))

% Input = 2 (-ΔCt [normalized ChIP]) 

ΔΔCt [ChIP/NIS] = ΔCt [normalized ChIP] - ΔCt[normalized NIS/mock]

Fold Enrichment = 2 (-ΔΔCt [ChIP/NIS]) 

00.png

图:IP-WB结果展示


02
实验抗体选择

我们一直跟客户强调ChIP实验中,一定要首选ChIP级别抗体。为什么呢?其他级别抗体不可以么?解答这个问题,我们先了解下抗体说明书上抗体级别评判问题。我们抗体公司的官网上进行查看,我们会发现,不同的抗体应用范围不一样,就算是名称一样的抗体,也有应用类型的差别。如有的抗体只写了WB,有的写了WB、IHH、IF等,只有极少数的抗体应用类型上写到了ChIP。这些应用类型不是说写了WB就不能做其他实验,而是代表抗体公司没有测试或者测试失败。对于没有测试的抗体,只有WB级别的抗体,而老师坚持要用在ChIP实验上,也是可以的,但是我们要知道,这是需要承担试错的风险,因为这个抗体不一定能在ChIP实验中成功并且失败的可能性比较大。而那些写了应用类型有ChIP的抗体(所谓的ChIP级别抗体)首先能够保证在它已经试验的样本中ChIP结果能够复现(当然也不是说能够适用所有样本,但是毕竟风险要小一些)。所以我们回头来回答开头的问题了,为什么要尽量选择ChIP级别抗体当然是ChIP级别抗体风险更小一些啊,如果是经费充足,愿意试错,那也是ok的呀这也是为后人做出贡献不是


03
磁珠选择

进行了一抗孵育之后,我们需要一定的办法将一抗富集到的目的蛋白进行拉取,进而获得互作DNA。常用的办法就是用磁珠了。在磁珠的选择上,有protein A、protein G或者是Protein A/G的磁珠选择哪种磁珠更合适呢?我们看看下表吧:

00.png:IP-WB结果展示

04
其他注意事项

除了以上介绍的外,还有如IP实验的buffer(pH、浓度等)洗脱温度、时间等都对最终结果有影响。所以ChIP实验需要大量的经验才能保证成功。自己实验的话,一定要提前尝试多种条件进行优化哦。


了,介绍了这么多,大家有没有对ChIP的IP过程有了深入了解呢?爱基百客生物的ChIP实验,好评不是的,文章数量靠客户堆的


话不多说,ChIP实验有困难,爱基。爱基百客致力于研究各种疑难样本的表观技术研发,竭尽微薄力量为表观技术添砖加瓦。



END


微信公众号二维码图2.jpg



本文网址:http://www.igenebook.com/news/604.html

关键词:ChIP,IP,免疫共沉淀

最近浏览:

联系我们

企业名称:武汉爱基百客生物科技有限公司

电话:027-87606602(市场部)  027-62431231(行政部)

Q Q :  270105245   1511879086  

          465436937   812115916

传真:027-87606602

邮箱:support@igenebook.com

地址:武汉市东湖高新区高新大道888号高农生物

          园高农国际1栋  

网址:www.igenebook.com


热推产品  |  主营区域: 江苏 天津 武汉 上海 北京 湖北
  • 在线客服
  • 联系电话

    027-87606602

  • 在线留言
  • 官方微信
  • 在线咨询
    欢迎给我们留言
    请在此输入留言内容,我们会尽快与您联系。
    姓名
    联系人
    电话
    座机/手机号码
    邮箱
    邮箱
    地址
    地址