客户文章 | New Phytologist发表番茄成熟的表观遗传新线索

发表单位：中国科学院华南植物园

发表日期：2021年11月2日

期       刊：New Phytologist（IF:10.151）

        2021年11月2日权威植物学杂志New Phytologist（IF:10.151）在线发表中国科学院华南植物园段学武研究员团队题为“SlJMJ7 orchestrates tomato fruit ripening via crosstalk between H3K4me3 and DML2-mediated DNA demethylation”的研究论文。该研究联合全基因组转录、结合位点、组蛋白H3K4me3和DNA甲基化分析证明SlJMJ7作为果实成熟的主要负调控因子，不仅通过直接去除多个关键成熟相关因子的H3K4me3，还通过组蛋白和DNA去甲基化之间的相互作用发挥作用。爱基百客为该研究提供WGBS的技术支持。

研究背景

        果实成熟是一个独特的过程，涉及颜色、质地、风味和营养的巨大变化。番茄因其遗传转化相对容易、生命周期短、基因组注释丰富等特点，已成为研究果实成熟调控机制的模型系统。尽管已知番茄果实成熟受乙烯、成熟相关转录因子和DML2介导的DNA去甲基化的复杂作用控制，但尚不清楚是否有其他类型的表观遗传修饰在这一过程中发挥作用。作者前期研究显示SlJMJ7可能参与番茄果实成熟调控，所以重点研究了SlJMJ7在果实成熟过程中的作用及其机理。

研究思路

研究结果

1.SIJMJ7是果实成熟的一直因子

作者构建了超表达SlJMJ7-OE7和SlJMJ7-OE9株系，它们表现出较高的转录和蛋白水平（图1. a和b）；另外，通过CRISPR-Cas9基因编辑系统构建SlJMJ7功能丧失突变体sljmj7-1和sljmj7-2（SlJMJ7第一个外显子分别缺失203和61bp），它们既没有转录本也没有SlJMJ7蛋白的检出（图1. c和d）。

对这些转基因植株果实进行分析，SlJMJ7-OE株系表现出果实晚成熟（平均晚3.5天），而SlJMJ7功能丧失突变体株系则表现出果实加速成熟（平均早4.7天）（图1. e）。此外，在38和42dpa（days post-anthesis，开花后天数），与野生型比较SlJMJ7-OE株系的果实拥有较低的乙烯产量速率、α-胡萝卜素和番茄红素浓度，但表现出较高的叶绿素含量（图1. f）。除了42dpa的番茄红素结果，sljmj突变体表现出相反的模式。这些数据表明SlJMJ7是番茄果实成熟的抑制因子。

作者随后利用了Western blot分析了野生型番茄在不同成熟阶段SlJMJ7蛋白表达模式，结果发现从果实早期（20dpa）到绿熟期（38dpa）SlJMJ7表达增长（图1. g）。然而，野生型中SlJMJ7的蛋白丰度从绿熟期到破色期（42dpa）再到转色期（46dpa）表现出明显地减少（图1. h）。从不成熟期（IM；30dpa）到绿熟期再到转色期，在SlJMJ7-OE突变体果实中也检测到同样的模式（图1. i）。这些数据表明，SlJMJ7蛋白在番茄果实成熟开始时积累，但在破色期下降。综上所述，SlJMJ7作为番茄果实成熟的抑制因子发挥调控作用。

图1. SlJMJ7是番茄果实成熟的抑制因子

2. SlJMJ7是一种位点特异的组蛋白H3K4去甲基化酶

SlJMJ7含有一个组蛋白去甲基化功能的JmjC结构域，作者在体内研究了SlJMJ7是否具有特定类型的组蛋白去甲基化酶活性。SlJMJ7-GFP在烟草叶子表皮细胞中瞬时表达，免疫荧光检测结果显示SlJMJ7-GFP定位于细胞核，其表达显著降低了细胞核内单甲基、双甲基和三甲基H3K4 的信号强度（图2. a）。然而，甲基化信号在H3K9、H3K27、H3K36位点无明显变化。此外，当H3K4去甲基化酶上两个保守的铁结合氨基酸（His288和Glu290）被丙氨酸取代后，SlJMJ7-GFP的H3K4去甲基化酶酶活性失活（图2. b），这意味着这些氨基酸对SlJMJ7-GFP组蛋白H3K4的去甲基化酶活性至关重要。

利用Western blot技术在突变体和野生型中进一步确认H3K4去甲基化酶活性。与野生型比较，在sljmj7突变体中H3K4的单、双和三甲基化程度较高，而在SlJMJ7-OE突变体中H3K4的单、双和三甲基化程度较低（图2. c-f）。为了在体外进一步确认SlJMJ7的酶活性，作者在烟草叶片瞬时表达SlJMJ7-GFP，并免疫亲和纯化。如图2. （g和h）所示，SlJMJ7-GFP减少了H3K4m3、H3K4m2和H3K4m1的水平，而没有减少H3K9me1/2/3、 H3K27me1/2/3 和H3K36me1/2/3的水平。以上这些结果表明SlJMJ7是一种位点特异的组蛋白H3K4去甲基化酶。

图2. SlJMJ7是番茄组蛋白H3K4的去甲基化酶

3. SlJMJ7通过H3K4me3去甲基化抑制靶基因的表达

为了检查SlJMJ7调控果实成熟的作用，作者利用RNA-seq分析野生型和sljmj7-1株系在38dpa的果实。由于sljmj7-1株系果实表现出早期果实成熟表型，sljmj7-1株系被随机选作之后的研究。在38dpa，野生型的果实在绿熟期，而sljmj7-1株系果实是在破色期。RNA-seq后统计分析上下调基因（图3. a），结果表明在sljmj7-1突变体中，乙烯生物合成、转录调控、类胡萝卜素生物合成、类黄酮/花青素生物合成和细胞壁组织等与成熟相关的一系列基因表达上调（图3. b）。RT-PCR进一步证实RNA-seq数据的可靠性。总的来说，这部分数据暗示SlJMJ7可能通过调控相关基因（包括乙烯生物合成、转录调控、类胡萝卜素生物合成、类黄酮/花青素生物合成和细胞壁组织）的转录，从而抑制果实成熟。

为了在全基因组范围内鉴定SlJMJ7的直接靶物，作者选取SlJMJ7-OE7（带有GFP标签）突变体果实（38dpa）进行ChIP-seq（利用抗GFP抗体）分析。从3个生物重复中共鉴定出8118个共有峰，作者认为这些峰对应于SlJMJ7的直接结合位点。这些结合位点随机分布在番茄的不同染色体上，结合位点大部分（61.33%）位于基因体区域，而19.11%和19.56%分别位于基因间和启动子区域（图3. c）。Read密度分析进一步表明这些SlJMJ7结合位点均匀分布在转录起始位点（TSS）和转录结束位点之间（TES）（图3. d）。Motif富集分析证明SlJMJ7与潜在靶基因的motif结合，比如Bapx1（24.64%）、LRF （22.02%）、TCX2 （18.40%）、SOL1 （18.02%）和NF1 （13.78%）（图3. e）。这表明SlJMJ7可能通过序列特异性转录因子被招募到其靶点上。

既然SlJMJ7有H3K4去甲基化酶活性，作者进一步研究SlJMJ7是否通过消除H3K4me3来调控靶基因的表达。利用抗H3K4me3抗体的ChIP-seq分析38dpa的野生型和sljmj7-1果实的全基因组范围H3K4me3。与野生型比较sljmj7突变体鉴定得到1375位点有H3K4me3水平增长，有779个位点表现出减少的H3K4me3水平。这些表现出SlJMJ7介导的H3K4me3去甲基化位点分布在不同基因区域，包括启动子-TSS、TSS、外显子、内含子和基因间区，其中外显子（33.11%）和内含子（24.98%）占整个基因组的最大比例（图3. f）。此外，野生型和sljmj7-1突变体的H3K4m3分布和热图分析显示H3K4me3位点主要位于启动子区和基因体的5’末端（图3. g和h）。在sljmj7突变体果实中，H3K4me3水平的升高可能促进其靶基因的表达。

为了确定SlJMJ7的直接调控基因，作者将RNA-seq数据与两次ChIP-seq数据整合。与SlJMJ7结合且在sljmj7突变体有上调表达、H3K4me3水平增加的被定义为SlJMJ7的直接靶基因。Venn图显示262个基因直接受sljmj7介导的H3K4me3去甲基化调控（图3. i）。这些基因主要与半胱氨酸和蛋氨酸代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，MAPK信号通路以及吲哚生物碱的生物合成有关（图3. j）。这部分联合分析表明，SlJMJ7通过消除H3K4me3抑制靶基因的表达，尤其是那些与果实成熟调控相关的基因。

图3. 番茄中SIJMJ7通过对H3K4去甲基化抑制靶基因

4. SIJMJ7与果实成熟关键基因结合并通过H3K4me3去甲基化抑制它们的表达

既然研究发现SlJMJ7介导的H3K4me3去甲基化直接抑制了几个成熟相关基因，作者使用ChIP-qPCR进一步确认SlJMJ7对乙烯合成基因（ACS2和ACS4）和转录因子（RIN和NOR）的结合以及H3K4me3修饰。基因组数据可视化清晰地显示SlJMJ7富集在成熟相关基因的基因体区域（图4. a）。此外，SlJMJ7结合位点和H3K4me3修饰位点在成熟相关基因上重叠良好（图4. a和b）。ChIP-qPCR证实在果实成熟过程中SlJMJ7直接结合这些基因（图4. c）。在sljmj7-1突变体中这些基因的H3K4me3水平高于野生型（图4. d）。与野生型果实比较，RT-PCR进一步确认成熟相关基因的表达在sljmj7-1突变体中显著上调，在SlJMJ-OE7突变体中显著下调（图4. e）。

为了进一步阐明果实成熟过程中SlJMJ7介导的H3K4me3去甲基化作用，作者分析了SlJMJ7在结合区域的结合活性和ACS2、ACS4、RIN以及NOR染色质上H3K4me3水平变化，还有在成熟过程中这些基因在野生型中的表达情况。从早果期（early fruit）到绿熟期（mature green）SlJMJ7在ACS2、ACS4、RIN和NOR染色质结合区域的结合增加，随着成熟的推进（破色期，break stage）结合下降（图4. f）；然而这些基因的H3K4me3和转录水平表现出相反的趋势。综上，这些发现证明SlJMJ7在番茄成熟过程中通过H3K4me3去甲基化直接抑制一系列成熟关键基因的表达。

图4. 在番茄中，SlJMJ7直接与成熟关键基因结合，通过去除H3K4me3抑制其表达

5. 果实成熟过程中SIJMJ7介导的H3K4me3消除抑制DML2的表达

在全基因组范围内分析转录、结合位点和组蛋白修饰鉴定得到DML2，一个关键的DNA去甲基化酶基因，是SIJMJ7的直接靶基因。这暗示SIJMJ7可能通过DML2间接调控DNA甲基化。为了确认这一推论，作者研究了SIJMJ7对DML2的动态调控。全基因组可视化显示SIJMJ7结合点发生在DML2的基因体区域（图5. a）。ChIP-qPCR分析显示38dpa的野生型果实中SIJMJ7在DML2位点富集，然而SIJMJ7结合水平在42dpa（破色期）显著减少（图5. b）。在SIJMJ7-OE突变体果实中，在绿熟期SIJMJ7在DML2位点高度富集，但其结合在破色期显著减少（图5. c）。这些结果暗示在果实早期成熟过程中，SlJMJ7与DML2基因位点的结合减少。

与以往研究一致，野生型果实中DML2的表达在42dpa（破色期）爆炸式增长（图5. d）。此外，在38和42dpa，与野生型果实对比DML2的表达在sljmj7突变体果实显著上调。因此，SlJMJ7在果实成熟过程中可能特异抑制DML2基因表达。最后，作者评估了在野生型和sljmj7-1突变体果实中H3K4me3水平的动态变化。基因组数据可视化表明番茄SlJMJ7突变（sljmj7-1）导致DML2位点H3K4me3水平的显著升高（图5. e）。与DML2表达模式一致，DML2的P1和P2区42dpa时期的H3K4me3水平高于38dpa时期（图5. f）。综上所述，这些数据表明SlJMJ7在果实成熟过程中通过H3K4me3去甲基化直接特异性抑制DML2的表达。

图5. 在番茄果实成熟过程中，sljmj7介导的H3K4me3去除抑制了DML2的表达

6. 组蛋白去甲基化和DNA去甲基化的关联

SlJMJ7对DML2表达的直接抑制促使作者研究SlJMJ7功能的丧失是否会影响果实成熟过程中的DNA甲基化。对32dpa的野生型和sljmj7-1果实进行WGBS分析，每个株系3个重复以确定甲基化组。比较sljmj突变体和野生型果实甲基化水平确定三种类型（CG、CHG和CHH）的差异甲基化区域。与野生型比较，sljmj突变体CG、CHG和CHH三种类型分别有11585、5081和203个DMRs（差异甲基化区域），是去甲基化的（hypo-DMRs）（图6. a）。相反，只有249、978和74个DMRs是超甲基化的（hyper-DMRs）。这一结果反映sljmj7突变可能造成番茄果实全局上的DNA低甲基化。

类似于DML2的靶基因，hypo-DMRs也聚集在sljmj7突变体的染色体壁上（图6. b）。另外，作者还发现sljmj7突变体中hypo-DMRs富集在TE（25.72%）、启动子（24.12%）、基因间区（15.45%）和外显子（14.69%）区域（图6. c）；而hypo-DMRs富集在TE（44.66%）、内含子（29.59%）和基因间（13.88%）区域。早先有研究做过dml2突变体的甲基化图谱，作者发现sljmj7突变体的hypo-DMRs和dml2突变体的hyper-DMRs（CG、CHG和CHH三种类型）很好地重叠；sljmj7突变体中40.27%（2493/6191）hypo-DMRs在dml2突变体中被超甲基化（图6. d），这暗示SlJMJ7通过DML2调节DNA甲基化。

与野生型比较，SlJMJ7结合的成熟相关转录因子RIN和NOR在sljmj7突变体中被去甲基化（图6. e和f）。该结果由McBC-PCR和McrBC-qPCR进一步证实（图6. g和h）。综上所述，这些发现表明SlJMJ7可能通过抑制DML2表达来调控果实成熟过程中的DNA甲基化组。此外，SlJMJ7可能通过DML2介导的DNA去甲基化调控成熟相关基因的表达。

图6. 在番茄开花后38 d (dpa)，SlJMJ7功能的缺失导致番茄果实全基因组DNA低甲基化

结语

该研究作者提出了SlJMJ7调控番茄果实成熟的工作模式。在开始成熟的时候，SlJMJ7在果实中大量积累，通过H3K4me3去甲基化直接抑制乙烯生物合成基因、关键转录因子和下游成熟相关基因的表达。此外，SlJMJ7抑制DNA脱甲基酶DML2的表达，因此通过DNA甲基化间接抑制成熟相关基因的转录。SlJMJ7直接或间接抑制果实成熟相关基因的表达，从而抑制果实成熟。在破色期，随着SlJMJ7积累量的减少，抑制作用减轻，从而启动番茄果实成熟。该研究增加了我们在植物发育过程中调节基因表达的各种表观遗传修饰之间相互作用的知识。因此，控制果实中H3K4me3甲基化的时间和动力学可能为延长果实保存期限提供新的策略。

文献下载

2021-NPH-SlJMJ7.pdf