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Cell Reports | 拟南芥叶片感染假单胞菌的单细胞图谱分析
发表单位：加州大学戴维斯分校 发表日期：2023年6月20日 期 刊：Cell Reports（IF:8.8） 2023年6月20日加州大学戴维斯分校Gitta Coaker研究团队在期刊Cell Reports（IF:8.8）发表了题为“Single-cell profiling of Arabidopsis leaves to Pseudomonas syringae infection”的研究论文。作者以单细胞测序技术分析了植物对假单胞菌感染的反应，结果表明叶片表现出处于对立状态（免疫和易感）的细胞群，免疫和易感细胞群由细菌菌落大小和感染时间决定。他们的研究为单细胞水平探索植物宿主-病原体相互作用提供了一个框架。 过去研究植物与病原体的相互作用主要依赖于大块组织（即整叶或整根）的检测。尽管全基因组转录谱分析促进了我们对免疫反应的了解，但细胞反应是整个组织的平均反应。scRNA-seq在单细胞水平和全基因组范围内对群体进行检测，以分析来自不同细胞类型和细胞状态的转录组，为了解不同组织中的细胞特性、功能和发育提供了新的视角。关于病原体感染，目前仍不清楚一个组织内的大量植物细胞是如何反应的，以及病原体的接近程度如何在单细胞水平影响细胞反应的。该研究结合scRNA-seq和荧光报告的活细胞成像技术来研究植物细胞对病原体感染的反应。
1.拟南芥叶组织感染假单胞菌的scRNA-seq图谱分析 为了研究单细胞水平下植物对病原体感染的反应，作者首先分析了细菌在叶片内的分布。作者比较了野生型P. syringae pv. tomato DC3000 3xmCherry与DC3000 ΔhopQ1 3xmCherry在接种后0、4、10和24 h（hpi；图2）的细菌分布情况，结果显示两种细菌菌株的表现完全相同。hopQ1效应子缺失菌株经常被用作研究P. syringae的工具，它对拟南芥具有很强的毒性。因此作者使用标记有 3xmCherry 的毒性 P. syringae pv. tomato DC3000 ΔhopQ1（以下简称Pst DC3000）进行实验。将Pst DC3000接种到四周龄的拟南芥上，在24 hpi时，观察到Pst DC3000的斑点状分布以及叶片内菌落数量和面积的差异，表明细菌的定殖在空间上是可变的（图1A-1C）。在这一感染阶段，拟南芥叶片不表现出明显的症状，但细菌繁殖活跃。 Pst DC3000定殖于叶肉细胞之间的细胞间隙，操纵它们为微生物生长提供更有利的条件。为了显示Pst DC3000和拟南芥叶肉组织之间相互作用的动态，作者使用Tape-Arabidopsis Sandwich方法富集叶肉细胞（图1D），并使用10X Genomics scRNA-seq平台分析Pst DC3000和模拟处理样品的单细胞转录组（图1D）。作为对单细胞数据集的补充，作者还对原生质体和渗透叶片进行了bulk RNA-seq，在合并的单细胞和大量原生质体样本之间有很强的相关性（图3），表明原生质体不会严重影响大多数基因的表达。作者在进一步分析单细胞数据集时排除了原生质体诱导的基因。 作者利用基于图形的非监督聚类，识别了18个主要的细胞簇，并将它们进行了UMAP可视化（图1E）,每个簇都包含来自Pst DC3000和模拟处理的叶片的细胞（图1E和3D），然后利用每个簇内细胞的主要预测特征为整个群组指定细胞类型。还将单细胞数据集与之前发表的五个拟南芥叶片scRNA-seq数据集进行了整合与分析，结果表明，除了在较大的叶肉细胞群中Pst DC3000处理过的细胞密度增加外，本研究中绝大多数细胞在细胞类型上与其他研究中的细胞类型相似（图3F-N）。
图1 拟南芥感染假单胞菌的单细胞RNA-seq图谱分析。
图2. 拟南芥感染过程中Pst DC3000 WT-3xmCherry与Pst DC3000 ΔhopQ1-3xmCherry的比较。
图3. 单细胞数据集的数据质量。 2. scRNA-seq揭示叶片内从免疫性到易感性的细胞群 作者对来自Pst DC3000和模拟处理的细胞进行整合分析，发现来自感染叶片的大量细胞亚群构成M1-M5簇（图3D、5A和5B）。研究发现，在这5个细胞簇中，细菌感染诱导的基因表达量普遍高于其他细胞簇（图5C），作者将这5个细胞簇M1-M5称为病原体响应细胞簇。病原体反应簇中的一些细胞来自模拟处理的样品（图3D、5A和5B），然后，作者将模拟处理样本的细胞重新聚类，并检查了从整合数据集定义的细胞群的分布,尽管与Pst DC3000处理的细胞相比，M1-M5簇中的细胞更加分散，但仍保持了其独特的特征（图6A）。总之，该研究结果表明，植物细胞在接触病原体后的反应发生了重大变化。 为了研究在每个病原体响应簇中发生的转录重编程，作者进行了GO分析。簇M1和M2富集于与细菌防御反应、免疫反应和水杨酸（SA）反应相关的GO terms（图5D），簇M4和M5富集于茉莉酸（JA）响应和水分运输相关的GO terms（图5D）。这些结果表明，簇M1、M2与簇M4、M5的转录反应相反。为了证实这一结果，作者根据已知参与免疫或疾病的基因组的基因表达模块计算了免疫和易感性反应评分，这些基因在bulk RNA-seq分析中存在差异表达，与GO分析结果一致，簇M1和M2显示出较高的免疫反应得分，而簇M4和M5显示出较高的易感反应得分，簇M3没有显示出较强的平均响应得分（图4A）。 接下来，作者分析了与Pst DC3000免疫和易感性相关的已知基因的表达（图4B）。结果显示已知的植物免疫相关基因CBP60g、EDS5、FRK1和PR1在M1和M2簇中被诱导表达，相反，包括那些对JA和ABA响应的基因（例如，CORI1，CORI3和ABI1）在M4和M5簇被诱导表达，与免疫和易感性相关的特异性转录本在M3簇中被诱导，但与M1-M2簇和M4-M5簇相比，诱导的程度较低，这表明免疫和易感性之间存在一种过渡状态（图4A和6B）。这些数据表明，M1和M2代表免疫激活簇，M3是过渡簇，M4和M5代表易感簇（图4A和4B）。 为了预测病原体响应细胞簇的轨迹，作者使用Monocle 3进行了拟时序分析。为了避免不同细胞类型的影响，使用经Pst DC3000处理的M1-M14簇的叶肉细胞来推断疾病的发展轨迹。结果显示其轨迹基本上是线性的，经过非病原体响应簇（M6-M14），然后是免疫簇（M1和M2），过渡簇（M3），最后结束于易感簇（M4和M5；图4C）。 为了通过拟时序分析研究病原体的反应性，作者利用在bulk RNA-seq数据被识别为差异表达基因的模块分数，计算了特征得分以量化Pst DC3000对每个细胞的总体影响。当叠加在拟时序上时，Pst DC3000 特征评分在经历免疫的细胞（簇 M1 和 M2）中显著诱导，然后在经历与疾病易感性相关特征的细胞（簇 M3-M5）中趋于稳定或下降，这与植物-病原体相互作用动态性质一致（图4D）。这些结果表明，在一种兼容的互作方式下，病害从植物防御发展到过渡状态，并最终导致易感性。
图4. scRNA-seq揭示了叶片组织内从免疫反应到易感反应的疾病进展连续过程。
图5. 簇M1 - M5为病原菌响应簇。
图6. Mock和Pst DC3000处理细胞以及病原体响应簇中差异表达基因的重新聚类。 3.疾病进展过程中免疫和易感细胞标记物的可视化 作者试图通过实验验证拟时序预测，并调查感染过程中免疫和易感标记的表达。作者在两周大的拟南芥幼苗上使用了表面接种，并观察表面接种后细菌定植的时空动态。在24 hpi时，观察到点状荧光信号（图7A，中），观察细菌荧光信号的多个焦点平面表明，在24 hpi之前，细菌已定植于叶肉细胞之间的细胞间隙,在48 hpi和72 hpi时，作者观察到荧光点扩大和合并，表明细菌种群在这些阶段高度繁殖（图7A，中）。对每个菌落荧光强度的定量显示，随着时间的推移，荧光强度持续上升（图7A，右图）。 然后，作者对细胞簇标记基因和荧光标记的Pst DC3000在感染过程中的表达模式进行了可视化。作者从免疫或易感细胞簇的scRNA-seq分析中选择了相对高和特异表达的标记基因，与核定位信号（NLS）耦合的荧光转录报告基因使病原体感染期间细胞特异性植物反应得以可视化。 作者选择了三个免疫标记基因：FRK1、LipoP1和CBP60g，三个标记物在免疫簇M1和M2中均有高表达，在过渡簇M3中表达不一，但在易感簇M4和M5中低表达（图7B-7D左，图10A）。 作者使用了先前鉴定的转录报告基因pFRK1::NLS-3xmVENUS和新生成的转基因系pLipoP1/pCBP60g::NLS-3xmCitrine，在模拟接种的拟南芥真叶中均观察到低荧光信号（Mock，图7B-7D），而FRK1的表达在24 hpi时强烈诱导，在48和72 hpi时显著下调（图7B），表明FRK1在24 hpi的表达代表了表面接种的早期感染阶段，此外，作者还观察到LipoP1和CBP60g在24-48 hpi时被高度诱导表达（图7C和7D）。所有三种免疫标记物FRK1、CBP60g和LipoP1在24 hpi时都表现出更局部的诱导。当植株表现出萎蔫和浸水症状时，所有免疫标记物的表达在72 hpi时显著降低（图7B-7D）。总之，这些数据突显了免疫标记基因在早期感染阶段的激活和晚期阶段的下调，与伪时间轨迹一致。 作者研究了在M4和M5簇中强烈表达的三个易感性标记基因的表达情况：EXPA10, PIP1;4和ILL5。这三个易感标记在易感簇M4和M5中均有高表达（图8A-8C，左；图10B），EXPA10和ILL5在过渡簇M3中的表达相对较弱，而在免疫簇M1和M2中的表达较低，PIP1;4在M1-M3簇中表达，但水平低于M4和M5（图8A，B，C）。 EXPA10和PIP1;4转录报告基因株系在模拟接种植株中的表达量较低，接种后表达量不断增加，在72 hpi达到峰值（图8A、8B、9D和9E），ILL5转录报告基因株系在模拟接种植株中的表达水平较低，而在48 hpi时表达水平达到峰值（图8C和9F）。ILL5的表达在72 hpi时略有下降，但仍高于24 hpi（图8C和9F）。因此，易感标记在细菌感染后被激活，并在感染后期被强烈诱导，这些数据强调了易感基因在感染后期的表达，与伪时间轨迹一致。
图7. 假单胞菌感染期间免疫标记表达的时间动态。
图8. 假单胞菌感染期间易感标记表达的时间动态。
图 9. 疾病进展过程中免疫和易感细胞标记物的可视化。
图10. 标记基因特征图和免疫标记表达模式。 4. 免疫和易感标记基因表现出不同的空间表达模式 用注射器和表面接种后，细菌在叶片上的定植表现出异质性（图1A和图7A），转录报告基因系使作者能够以单细胞分辨率高灵敏度地检测标记基因的表达，因此，作者研究了表面接种Pst DC3000后病原体反应细胞的空间定位。首先，作者检测了FRK1免疫标记基因在24 hpi时表达最高时的表达情况（图7B），FRK1在模拟处理样品中很少表达，但在被细菌定殖的下气孔周围的细胞中经常观察到（图11A）。作者对共聚焦显微照片进行了量化，以确定FRK1表达细胞的空间定位，接种Pst DC3000后，91%表达FRK1的细胞围绕着下气孔（图11B），接下来，作者量化了表达FRK1的细胞与细菌菌落的接近程度，75%的FRK1表达细胞靠近细菌菌落（<15 mm）（图11C）。这些数据表明，FRK1是已知的最早的PTI标记基因之一，在细菌入侵部位表现出强而特异的表达。 与FRK1不同，LipoP1转录报告系在感染过程中表现出空间表达模式的动态变化。在没有病原体感染的情况下，LipoP1在气孔两侧的保卫细胞中表达（图7C和9C），在24 hpi时，60%的表达LipoP1的细胞靠近细菌菌落（<15 mm；图10C）。然而，LipoP1在48 hpi和72 hpi表现出不同的空间表达，要么在所有细胞中被普遍诱导，要么在细菌菌落周围的细胞中被高度诱导，这可能是由于不同叶片内细菌感染不同步造成的。作者使用细菌荧光强度作为细菌菌落大小的替代指标，分析了LipoP1随时间变化的表达模式。特别地是，作者在细菌菌落周围的细胞中观察到两种LipoP1的表达模式：一种是荧光强度小于300像素/mm2的菌落周围的强表达模式（集束模式），另一种是荧光强度大于400像素/mm2的较大菌落的边缘也有表达（边缘表达，图11D-11F），并且束状和边缘 LipoP1 表达模式明显高于未定植区域（图10D）。总之，这些结果表明不同的LipoP1表达模式与细菌种群数量有关。 CPB60g编码一个主免疫转录因子，它与SARD1同时调节植物防御激素SA的合成。在没有病原体感染的情况下，CBP60g通常在所有细胞中以低水平表达，Pst DC3000接种后，CPB60g转录报告基因表现出与LipoP1相似的诱导模式，包括一般模式、束状模式和边缘模式（图11G和11H）。CPB60g的普遍诱导可能反映了其在SA生物发生和NPR1转录调控中的作用，这对于叶内和系统免疫反应至关重要。 免疫标记物的表达与细菌定植之间的空间关联令人好奇，这促使作者研究易感标记物的表达是否与细菌定植存在空间关联。作者观察到易感标记EXPA10在靠近细菌强力定植区域的大面积叶片中更广泛地诱导表达（图11I），这与免疫标记物FRK1、LipoP1和CBP60g更具特异的表达形成了鲜明对比。EXPA10和PIP1;4的报告系在没有病原体侵染的情况下，在表皮和叶肉细胞中出可检测到表达（图8，9E和 9F），相比之下，在没有细菌感染的情况下，ILL5主要在保卫细胞中表达，但在48-72 hpi时在表皮、叶肉和保卫细胞中被强烈诱导表达（图11J和11K）。总之，代表免疫和易感标记物的转录报告系揭示了疾病进展过程中免疫标记物表现出不同的空间和时间表达模式，而易感标记物则表现出更广泛和持续的表达模式以响应毒性Pst DC3000（图 12）。
图11. 假单胞菌感染后免疫和易感标记表达的空间动态。
图12. 免疫和易感标记基因表达的时空模型 作者利用scRNA-seq结合转录报告基因系的共聚焦成像技术揭示了受感染叶片内细胞的植物异质性，并在单细胞水平上提供了植物对感染的不同反应。对整个疾病发展过程中的细胞状态进行详细描述，这将有助于全面了解疾病进展的调控机制。
文献链接：DOI: 10.1016/j.celrep.2023.112676 爱基百客先后引进10x Genomics 、SeekOne® DD单细胞平台，可以提供从前期样本制备到测序以及后期分析的完整服务，已协助客户在Genome Biology、Protein & Cell、 Journal of Hematology & Oncology等杂志发表诸多高水平文章。 在植物单细胞测序方面进行了近40余种不同植物材料的单细胞核提取以及原生质体制备测试研发，已完成水稻、拟南芥、小麦、烟草等模式以及非模式植物的单细胞科研服务。 了 解 更 多 { 往 期 精 彩 回 顾 } 精选合集，欢迎收藏哟！ |
