客户文章 | RIP/CLIP技术助阵研究胰腺癌中CLK1/SRSF5诱导的METL14和Cyclin L2外显子跳跃

发表期刊：Journal of Hematology & Oncology（IF: 11.059）

研究材料

临床胰腺癌及其癌旁正常组织、PANC-1和BxPC-3细胞

研究技术

RNA-seq、RIP-qPCR、CLIP-qPCR、磷酸化蛋白组、RNA pull down、 Co-IP等

文章思路

研究背景

异常选择性剪接和m6A甲基化在胰腺癌(PC)的发生发展中都发挥着复杂的作用，但这两种RNA修饰之间的关系尚不清楚。

研究结果

  在PDAC组织中，CLK1的mRNA和蛋白水平均显著升高。CLK1高表达与不良预后相关。体外和体内实验表明，CLK1表达升高可促进PC细胞的生长和转移。从机制上讲，CLK1增强了SRSF5上的磷酸化，抑制了METTL14 exon10的跳变，同时促进了Cyclin L2exon6.3的跳跃。此外，异常的METTL14 exon10跳跃增强了N6 -甲基腺苷修饰水平和转移，而异常的Cyclin L2exon6.3促进了PDAC细胞的增殖。CLK1/SRSF5通路诱导METTL14和Cyclin L2的异常外显子跳跃，从而促进PDAC细胞的生长和转移，并调控m6A甲基化。本研究表明该通路在PDAC患者中具有潜在的预后价值和治疗靶向性。

1、胰腺癌组织中CLK1表达升高与PDAC患者预后恶化相关

  15对胰腺癌及其癌旁正常组织样本的RNA-seq分析发现CLK1为鉴定出的唯一的一个与选择性剪接相关的过表达基因。从公共数据库GEO和TCGA数据库中发现CLK1在大多数胰腺癌组织中比正常组织表达量高。检测不同细胞中CLK1的基因表达情况及蛋白表达情况，并且IHC检测病例样本中针对CLK1的情况，结果表明预后较差的病人中CLK1的表达量增高。CLK1敲除或者过表达的细胞中进行细胞生长状态观察、以及细胞迁移和侵袭实验，并且在裸鼠中进行肺解剖观察及迁移实验，确定CLK1的表达促进胰腺癌细胞在体内及体外的转移能力。

2、  CLK1广泛调控可变剪接相关蛋白的磷酸化，尤其是SRSF5的250位 serine

   CLK1-KD细胞和CLK1-OE细胞的RNA-seq结果分析发现CLK1参与调控细胞循环。针对CLK1的磷酸化蛋白组鉴定出了39个上调，62个下调。GO分析发现CLK1主要参与mRNA可变剪接相关蛋白的磷酸化，尤其是SR蛋白家族。在这些磷酸化水平下调的蛋白中，SRSF5在ser-250位置上磷酸化的SRSF最显著。CLK1-KD细胞中WB检测SR基因家族蛋白表达情况。结果发现只有ser-250位置磷酸化的SRSF5水平降低，其他SR家族成员包括SRSF1、SRSF3和SRSF6都不变化，并且SRSF5-ser-250的表达水平与CLK1表达水平一致—CLK1表达水平下降，SRSF5表达下降，CLK1表达增高，SRSF5表达也增高。构建SRSF5-ser-250 WT和MU载体并转化入Panc1细胞中，发现SRSF5-ser-250 WT样本磷酸化水平增加，突变体无变化，并且这种磷酸化水平增加的情况下加入了TG003这种CLK1磷酸化抑制剂时磷酸化情况抵消了。但是在Bxpc-3细胞中未出现这种情况。进一步用Co-IP实验证实了CLK1和SRSF5在PANC-1和BxPC-3细胞内的互作。内生Co-IP实验也证实了CLK1和SRSF5的互作。在PANC-1和BxPC-3细胞中进行IF实验，发现CLK1和SRSF5共定位在核内。在组织中进行IHC实验发现肿瘤组织中CLK1高表达样本也伴随着高SRSF5磷酸化水平。临床样本的WB实验也证实了CLK1和磷酸化SRSF5表达水平一致。

   病人在有CLK1高表达、SRSF5高表达时，预后效果很差。当CLK1表达下降，不论SRSF5表达高或者低，病人预后效果相差无几。而当SRSF5在核内表达降低，不论CLK1表达高或者低，病人预后效果也是相差无几。这些结果表明临床上胰腺癌预后效果判断需要结合CLK1与SRSF5共同判断。生存率统计上CLK1和SRSF5共同高表达时生存率最低，CLK1和SRSF5表达都低时生存率最高。

3、SRSF5控制胰腺癌细胞中METTL14和Cyclin L2的外显子跳跃

  慢病毒介导构建SRSF5不同异构体的过表达：SRSF5在250位丝氨酸位点突变（S250 MU）、SRSF5在250位丝氨酸磷酸化（S250P）以及野生型SRSF5 （S250 WT）。将这些不同异构体在PANC-1细胞中过表达。菌落形成、转移实验以及CCK8分化和细胞计数分析都表明SRSF5250W促进细胞分化和迁移而不是SRSF5250m，这种促分化和迁移事件会因为添加抑制剂TG003而逆转。但是这种结果在BxPC-3细胞中并没有出现，反而是SRSF5-S250P促分化和转移。为了验证这种差异是否是由于CLK1表达差异造成，作者进一步检验在CLK1存在或者缺失的情况下SRSF5的功能发现在PANC-1细胞中CLK1表达沉默会影响SRSF5-WT的促分化功能，但是SRSF5-250P在CLK1表达沉默时仍然会促分化。就算是用抑制剂TG003处理，SRSF5-250P过表达后仍然会促进细胞分化和迁移。在PANC-1和BxPC-3细胞中，磷酸化的SRSF5可能会促使CLK1调控EMT途径和细胞循环，SRSF5-250P过表达会改变E-钙黏素、波形蛋白、p53以及p21的表达。在裸鼠中也得到类似的结果。

  在两组PC细胞（A组：慢病毒介导的对照组和CLK1过表达组；B组：SRSF5-WT或SRSF5-MU稳定表达组）中进行RNA-seq，功能富集分析发现在两组中都存在METTL14 exon 10和Cyclin L2 exon6.3跳跃。RIP-qPCR证实SRSF5与METTL14和Cyclin L2互作，CLIP-qPCR进一步证实SRSF5结合METTL14的exon 10和Cyclin L2的exon 6.2。RNA pull down结果也表明METTL14和Cyclin L2与SRSF5强结合。在细胞PANC-1和BxPC-3细胞中，CLK1敲低促进Cyclin L2 exon 6.3外显子跳跃但是抑制METTL14的exon 10外显子跳跃，CLK1过表达得到相反的结果。在BxPC-3细胞中稳定沉默SRSF5并过表达SRSF5-WT或者SRSF5-S250Mu，结果发现只有在SRSF5-WT中CLK1能调控METTL14和Cyclin L2的外显子跳跃。

图：SRSF5控制METTL14和Cyclin L2的外显子跳跃

4、SRSF5提高m6A水平并且通过抑制METTL14的外显子跳跃来促进细胞分化和迁移

  因为METTL14主要涉及调控m6A，作者好奇METTL14的可变剪接是否影响m6A水平。在PANC-1中过表达SRSF5-WT和SRSF5-P都显著性增强m6A水平。慢病毒介导METTL14-L和METTL14-S发现METTL14-L相对于其他组m6A水平降低，并且METTL14-L组表现出强的细胞分化和迁移能力。另外SRSF5-WT过表达或者CLK1过表达都能做增加m6A水平和恶性激活行为包括细胞分化、群落形成和迁移以及侵袭，但是这种情况通过沉默METTL14-L可以完全或者部分反转。在PANC-1细胞中通过SRSF5沉默或者CLK1沉默抑或添加抑制剂TG003导致的这些恶性行为的损伤会因为METTL14-L而不是METTL14-S的异常表达而逆转。SRSF5通过促进Cyclin外显子跳跃来促进肿瘤分化，而异常的METTL14和Cyclin L2的外显子跳跃有益于PDAC的临床预后。

5、提出CLK1-SRSF5轴诱导m6A甲基转移酶metl14和Cyclin L2异常外显子跳跃通过调节细胞周期进展、细胞增殖和转移而促进胰腺癌发生的过程工作模型

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