Hi-C专题（一） | 3D基因组（三维基因组）与Hi-C技术的那些事儿

Hi-C测序日渐火爆，近年来高分文章层出不穷，成为了名副其实的科研黑马。Hi-C技术是源于基因组捕获技术（Chromosome conformation capture，3C），用来分析染色质三维空间结构的一种测序方法，主要是研究生物的3D基因组。自从2009年Hi-C技术首次被提出后，3D基因组的研究迎来了爆炸式的发展，相关的论文发表量增长了约6倍，可见其火爆。

NCBI近年来3D基因组相关的论文发表情况（截至2022.5.5）

3D基因组是什么？为什么要研究3D基因组？3D基因组研究的方向有哪些？小i同学今天先带大家了解下3D基因组一些概念。

随着技术的发展，基因组学取得了巨大的进展。不过提起基因的序列结构，我们大部分人可能第一反应是DNA双螺旋结构。实际上，基因组DNA是以多层级结构存在于细胞核内，而且就是这些多层级结构将2米长的DNA序列有序地压缩到10微米的细胞核内。这种压缩结构存在三维空间构象，可以在空间距离上拉近线性距离相距甚远的基因区域。

Doğan E.S. and Liu C. Nature Plants. 2018

基因的表达除了由自身的编码序列决定外，还由非编码区调控元件控制。基因的表达、调控及调控元件之间的互作是在染色体折叠而成的三维结构中完成的。故研究基因组的3D结构对于揭示基因的表达与调控显得非常有必要。

生物体在环境、发育进程等变化中，存在不改变DNA线性序列的情况下，通过调节DNA的三维空间结构，改变调控元件与靶基因的空间互作，从而调节基因的表达。我们爱基百客的客户《鸡卵泡发育过程中颗粒细胞的转录组动态和染色质结构》研究论文中（客户文章 | Nature Communication鸡卵泡发育过程中颗粒细胞的转录组动态和染色质结构），作者就采用了Hi-C测序技术探索了鸡卵泡颗粒细胞的染色质结构、染色质区室、TADs和染色质环在三个不同的发育时期是否存在差异，结果显示卵泡发育过程中染色质结构的整体重排与转录组的分化存在一致性。

随着技术的进步和研究的深入，越来越多的研究显示3D基因组结构在调控基因表达和细胞功能上扮演着重要的角色。

了解3D基因组的概念和其研究的重要价值后，我们再来关注下3D基因组的研究内容。主要分为4个层级：染色质疆域、染色质区室、拓扑关联结构域和染色质环。

1. 染色质疆域（Chromosome territory）

何谓染色质疆域？举个例子，人类的染色体有46条，它们在细胞核内并不是随机分布的，而是都有各自“领土”，这种现象就是染色质疆域。染色质疆域让我们迈出了认识染色质空间结构的第一步，这种现象存在于从酵母到人类的各种各样的真核生物中。基因丰富的染色体疆域主要存在于细胞核中心，基因贫乏的染色体疆域主要存在于核的外围。

Kempfer R and Pombo A. Nat Rev Genet. 2020

2. 染色质区室（Compartments）

在Hi-C的研究中发现基因组被分为两个染色质区室：A染色质区室（A compartment）和B染色质区室（B compartment）。

A染色质区室主要是开放的染色质，表达活跃，基因密集，具有较高的GC含量，包含用于主动转录的组蛋白标记物，通常位于细胞核的内部；B染色质区室里的染色质是关闭的，表达也不活跃，基因缺乏，结构紧凑，含有基因沉默的组蛋白标志物，主要位于核的外围。

Kempfer R and Pombo A. Nat Rev Genet. 2020

3. 拓扑关联结构域（Topological Associated Domains，TADs）

基因组区域内有一些高互相作用频率的离散区域，这些区域就是拓扑结构域（TADs）。它被低互相作用区域所包围，这些区域被称为TAD边界（TAD boundaries）。TAD边界具有屏障活性，可以阻止异染色质从相邻结构域扩散。此外，TAD边界富集H3K27me3修饰、Suz12、RNA聚合酶II和CTCF结合位点。

Matharu N and Ahituv N. Plos Genet. 2015

4. 染色质环（Chromatin loops）

染色质环是由CCCTC结合因子（CTCF）或者由增强子-启动子contacts介导的形成。局部区域的两个基因位点存在高频互作是构成DNA环的基础。染色质环可以让线性距离相聚甚远的基因与调控元件结合互作，从而调控基因的转录和表达。

科研黑马Hi-C的技术是如何修炼的？

        工欲善其事，必先利其器。上面谈了3D基因组的分析内容，再来关注下研究3D基因组的利器——Hi-C测序技术。Job Dekker团队2009年在Science发表“Comprehensive mapping of long range interactions revealsfolding principles of the human genome”论文，首次提出Hi-C技术，并利用该技术对人类正常淋巴母细胞染色体中基因座空间交互信息进行分析。此后，利用Hi-C技术研究染色质3D结构的文章越来越多。

Hi-C技术原理和流程并不复杂，它将染色质构象捕获与高通量测序技术很好地结合，主要技术流程分6部分：染色质交联、内切酶酶切、生物素补平、连接、DNA纯化及捕获和高通量测序。

1. 染色质交联

蛋白质是DNA形成高级结构的必要条件，但在后续实验中很容易被破坏。故用甲醛处理，将细胞内的蛋白质变性固定。

2. 内切酶酶切

使用核酸内切酶在特定的序列切断DNA，切断后产生粘性末端。

3. 生物素补平

产生的粘性末端用碱基补平，其中特定的碱基带有生物素标签。

4. 连接

在连接酶的作用下，平末端两两相连，形成一段新的嵌和片段。这种连接主要发生在空间位置较为接近的平末端之间。最后连接位点形成了一段固定的序列，并带有生物素标签。

5. 解交联

将DNA纯化和剪切，然后利用链霉素亲和素磁珠捕获带有生物素的序列。

6. 高通量测序

将捕获的序列进行建库，测序。

结语：

文章的篇幅稍微有点长，本期内容主要介绍了3D基因组的一些概念和研究内容以及Hi-C的技术原理。近年来非常流行将Hi-C技术与ATAC-seq、ChIP-seq、RNA-seq等技术结合，相关的研究论文发表在一些权威期刊，下期小i同学将结合一些文献谈谈Hi-C多组学的分析思路。

参考文献：

1. Kempfer R and Pombo A. Methods for mapping 3D chromosome architecture. Nat Rev Genet. 2020. 21:207-226.

2. Matharu N and Ahituv N. Minor Loops in Major Folds: Enhancer-Promoter Looping, Chromatin Restructuring, and Their Association with Transcriptional Regulation and Disease. Plos Genet. 2015. 11(12): e1005640.

3. Lieberman-Aiden et al. Comprehensive mapping of long range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 2009. 326: 289-93.

4. Li et al. Dynamic transcriptome and chromatin architecture in granulosa cells during chicken folliculogenesis. Nat Commun. 2022. 13:131.

5. Szczepińska et al. Intermingling of chromosome territories. Genes Chromosomes Cancer. 2019. 58: 500-506.

6. Doğan ES and Liu C. Three-dimensional chromatin packing and positioning of plant genomes. Nature Plants. 2018. 4: 521-529.