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武汉爱基百客生物科技有限公司(简称爱基百客),注册于2014年12月31日,次年10月正式开始对外运营,是一家专业提供表观组学技术服务、高通量测序、单细胞测序分析的新型生物科技服务企业。

公司总员工已达到百余人,其中95%以上具有学士学位,40%以上具有硕士及以上学位,专职科研人员20余人,专职销售人员30余人,覆盖全国90%的省市,核心成员来自国内知名高效、基因测序公司、信息分析公司等。

公司运营至今销售额累积1亿左右,成为国内成长最迅速的二代测序与生物科研服务企业之一。




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浅谈RNA甲基化研究思路


什么是RNA的m6A甲基化修饰?


有很多老师在查阅文献寻找研究思路时,会发现在许多领域都有着m6A的身影,这个RNA修饰在发育、疾病、肿瘤发生、治疗等生理活动中都起着极为重要的作用。那么就有很多老师想要问,我所想要研究的内容,例如疾病的发生、耐药、恶化、转移、治疗等,是否与m6A修饰有关,我该如何从这个方向开展我的研究并借此尝试挖掘出一条新的调控机制?在此,小编基于一定知识背景对m6A进行简单的描述,以期能够为各位老师提供可参考的思路。

m6A甲基化是指在甲基转移酶(writer)的作用下,RNA上腺嘌呤(A)的第六位N发生了甲基化的修饰,这种修饰能够被一些蛋白(reader)所识别,从而行使下游的一系列功能,包括miRNA加工、mRNA出核翻译及剪切等。此外,这种修饰状态并不是一成不变的,RNA去甲基化酶(eraser)能够将这种修饰状态去除,从而达到m6A修饰的动态变化。

小编参考了m6A研究的两个大牛团队(康奈尔大学Jaffrey教授团队与芝加哥大学何川教授团队),将m6A修饰相关蛋白进行了简单总结(见下表)。


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我该如何开展m6A修饰相关研究?


在获取了基础的m6A相关信息后,该如何将这些信息融合到自己的研究想法中呢?这个时候就需要阅读大量的文献,尤其是需要对m6A大课题组(例如芝加哥何川课题组、康奈尔Jaffrey课题组、北京大学贾桂芳课题组、中科院杨运桂课题组等)相关的研究文章思路进行整合和思考,从而使自己在构建研究路线时的思路更加清晰。小编在阅读了m6A研究相关文献后,在此简单列一些对m6A研究路线的想法,希望有助于各位老师在前期m6A探索时的思路参考。

2.1首先最好是有一些预实验或者是先验知识,比如说:

(1)相关蛋白的差异?

在前面,小编简单列了一些与RNA甲基化相关的酶和蛋白,在想要进行m6A研究之前,可以考虑通过WB、免疫组化、qPCR等实验来观察在不同样本(如不同疾病时期、生长发育、药物干预等)之间,是否存在表达明显变化的相关蛋白。此外,也可以查看TCGA等数据库已发表的研究数据中是否存在与自己的研究材料一致的研究,借由已发表的测序数据来挖掘相关酶和蛋白是否存在差异表达。例如下图,作者就是基于TCGA队列挖掘到了在腺瘤性结肠息肉病中METTL3酶的表达变化并利用WB进行了验证。

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(2)样本整体m6A修饰变化初测?

除了对相关蛋白进行预实验,还可以通过一些简单的手段例如酶标仪、LC-MS/MS以及dotblot等对m6A整体的修饰水平进行一个检测和分析,通过初测不同样本之间RNA的m6A的修饰是否发生了变化来考虑是否有必要进行后续m6A机制的深入挖掘。例如下图,作者就是利用了酶标法和dotblot法检测了正常肝组织与HCC组织中m6A整体修饰水平的差异。

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2.2 m6A修饰机理研究

在前期通过预实验或者数据挖掘发现在自己关心的表型方向RNA甲基化或相关酶/蛋白表达有变化之后,就可以考虑通过m6A-seq挖掘发生了差异甲基化的RNA及基因了。

(1)简单标配

不同差异比较组简单粗暴的m6A-seq和转录组测序。这类研究思路通常是m6A-seq搭配转录组测序,对联合分析结果中的数据和图表进行简单罗列,并对某些表达有差异基因进行qPCR、甲基化水平(如dotblot等)的验证【6】。影响因子不高,但研究简单,分析思路也比较容易理解。


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(2)细胞实验/动物实验的运用

在常规组织样本m6A测序的基础上,若前期挖掘到或有关注的相关酶,便可以进行酶敲除/过表达的细胞实验(体系更容易构建)/动物实验,同时结合m6A-seq以及mRNA-seq/miRNA-seq来观察哪些基因或小RNA受到了影响。

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(3)酶-基因调控机制挖掘与验证

这类文章通常除了常规的m6A测序与转录组测序之外,还会结合一些其他的测序实验,如ChIP-seq、RIP-seq、RNA Pulldown,以及一些验证实验如双荧光素酶等,来完善酶对下游靶RNA,或上游基因对酶的调控机制,随后通过这些基因/RNA的过表达/敲除实验观察是否能够对相关酶表达异常的表型进行补救。

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(4)新技术的联合与新的发现

除了传统的甲基化酶→靶基因→表型关联套路,m6A研究大牛们基于他们对m6A的了解,找到了一些新的能够与m6A结合的技术。例如何川课题组联合m6A与GWAS,定义了m6A的遗传图谱(m6A-QTL),陈建军、杨财广以及钱志坚教授基于对分子结构的了解,开发了去甲基化酶FTO的小分子抑制剂,国外诺丁汉大学的研究者们探究了m6A修饰与R-LOOP环之间的关联。然而这些新方向虽然具有发展潜力,一旦发现新的机制也能够具有冲击像Nature Genetics、Nature、Cell等顶级期刊的趋势,但同时存在很大风险,对经费的需求也很高。除非老师们前期已经对m6A相关机制、背景了解非常清晰,有大量的预实验能够支撑新方向的猜想,并且对新方向所涉及到的相关技术也了解比较透彻,否则对于这类方向有想法的老师还请谨慎对待。

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在此,小编仅跟大家简单探讨了m6A研究的相关思路,但究竟如何将这些思路与自己的研究结合,如何利用RNA甲基化发高分文章仍然任重而道远。爱基百客携手MeRIP-seq(m6A-IP-seq)与下游多种验证实验,希望能为各位老师提供技术上的帮助,同时也祝福老师们能够早日在理想的期刊上再创新篇!



参考文献:

【1】Meyer, K., & Jaffrey, S. R. (2017). Rethinking m6A Readers, Writers, and Erasers. Annual Review of Cell & Developmental Biology, 33(1), 319.

【2】Fu, Y., Dan, D., Rechavi, G., & He, C. (2014). Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics, 15(5), 293-306.

【3】Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T., & He, C. (2017). Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation. Cell, 169(7), 1187.

【4】Wang W, Shao F, Yang X, Wang J, Zhu R, Yang Y, Zhao G, Guo D, Sun Y, Wang J, Xue Q, Gao S, Gao Y, He J, Lu Z. METTL3 promotes tumour development by decreasing APC expression mediated by APC mRNA N6-methyladenosine-dependent YTHDF binding. Nat Commun. 2021 Jun 21;12(1):3803. doi: 10.1038/s41467-021-23501-5. Erratum in: Nat Commun. 2021 Jul 20;12(1):4529. PMID: 34155197; PMCID: PMC8217513.

【5】Ma JZ, Yang F, Zhou CC, Liu F, Yuan JH, Wang F, Wang TT, Xu QG, Zhou WP, Sun SH. METTL14 suppresses the metastatic potential of hepatocellular carcinoma by modulating N6 -methyladenosine-dependent primary MicroRNA processing. Hepatology. 2017 Feb;65(2):529-543. doi: 10.1002/hep.28885. Epub 2016 Dec 24. PMID: 27774652.

【6】Xue A, Huang Y, Li M, Wei Q, Bu Q. Comprehensive Analysis of Differential m6A RNA Methylomes in the Hippocampus of Cocaine-Conditioned Mice. Mol Neurobiol. 2021 Aug;58(8):3759-3768. doi: 10.1007/s12035-021-02363-4. Epub 2021 Apr 7. PMID: 33826069.

【7】Wang Q, Guo X, Li L, Gao Z, Su X, Ji M, Liu J. N6-methyladenosine METTL3 promotes cervical cancer tumorigenesis and Warburg effect through YTHDF1/HK2 modification. Cell Death Dis. 2020 Oct 24;11(10):911. doi: 10.1038/s41419-020-03071-y. PMID: 33099572; PMCID: PMC7585578.

【8】Chen Y, Zhao Y, Chen J, et al. ALKBH5 suppresses malignancy of hepatocellular carcinoma via m6A-guided epigenetic inhibition of LYPD1. Mol Cancer. 2020;19(1):123. Published 2020 Aug 10. doi:10.1186/s12943-020-01239-w

【9】Chen X, Xu M, Xu X, et al. METTL14-mediated N6-methyladenosine modification of SOX4 mRNA inhibits tumor metastasis in colorectal cancer. Mol Cancer. 2020;19(1):106. Published 2020 Jun 17. doi:10.1186/s12943-020-01220-7

【10】Zhang Z, Luo K, Zou Z, et al. Genetic analyses support the contribution of mRNA N6-methyladenosine (m6A) modification to human disease heritability. Nat Genet. 2020;52(9):939-949. doi:10.1038/s41588-020-0644-z

【11】Huang Y, Su R, Sheng Y, et al. Small-Molecule Targeting of Oncogenic FTO Demethylase in Acute Myeloid Leukemia. Cancer Cell. 2019;35(4):677-691.e10. doi:10.1016/j.ccell.2019.03.006

【12】Abakir A, Giles TC, Cristini A, et al. N6-methyladenosine regulates the stability of RNA:DNA hybrids in human cells. Nat Genet. 2020;52(1):48-55. doi:10.1038/s41588-019-0549-x


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