客户文章 | 全基因组甲基化测序联合转录组揭示黄鳝性反转的表观遗传信息

发表单位：上海海洋大学食品科学学院

发表日期：2021年7月12日

期       刊：Aquaculture research

2021年7月12日，上海海洋大学食品科学学院在杂志Aquaculture research发表题为“Comprehensive analysis of genome-wide DNA methylation and transcriptomics between ovary and testis in Monopterus albus”的研究论文。该研究采用了全基因组甲基化测序和转录组综合分析，比较了黄鳝卵巢和睾丸的差异甲基化基因和差异表达基因。该研究为黄鳝性反转提供了表观遗传信息。爱基百客为其提供了全基因组甲基化测序（WGBS）技术。

研究背景

自从发现黄鳝是雌雄同体，研究人员就对其性别决定和转换机制开始进行研究。黄鳝性别变化的研究，对于人工养殖、了解鱼类性别的决定和分化具有重要意义。已有研究发现了很多与黄鳝性别决定和分化的基因，但其分子机制尚不清楚。

研究思路

研究结果

1. 黄鳝卵巢和睾丸全基因组甲基化分析

为了研究黄鳝性反转过程中卵巢和睾丸的甲基化状态，作者对两份混合样本（每个性别3个个体）进行了全基因组亚硫酸氢盐测序。计算三种类型（CG、CHG和CHH）全基因组甲基化胞嘧啶的数量。睾丸组织有6.06%（mC）、78.29%（mCG）、0.38%（mCHG）和0.38%（mCHH）的甲基化水平，分别对应于所有序列的C、CG、CHG和CHH位点；卵巢在C、CG、CHG和CHH类型分别有4.86%、76.09%、0.31%和0.31%的甲基化。如图1.a，睾丸组织每种类型都观察到更高的甲基化水平；睾丸和卵巢中CG类型胞嘧啶甲基化占有最大的比例，高达~94%（图1. b）。此外，作者还计算了起始密码子上游3000 bp内CG位点的甲基化水平，其中睾丸为49.51%，卵巢为47.89%。

图1. 黄鳝卵巢和睾丸全基因组甲基化图谱

2. 差异甲基化基因(DMGs)的鉴定

由于mCG几乎占了所有甲基化的胞嘧啶，所以作者采用CG位点的甲基化胞嘧啶来测量甲基化比率的变化，并且将与卵巢比较分析差异的区域定义差异甲基化区域（DMRs）。共检测到20402个DMRs，包括13578个超甲基化和6824个低甲基化DMRs。为了确定甲基化在黄鳝性别变化过程中的潜在作用，在睾丸和卵巢之间共鉴定出1718个差异甲基化基因（DMGs），至少有一个DMR位于起始密码子上游3000 bp内，890个是超甲基化的，828个是去甲基化的。

为了研究差异甲基化基因的功能，作者做了GO富集分析（图2）。在生物过程分类中，DMGs主要富集于减数分裂、生殖和脂肪酸相关条目。在分子功能组中，DMGs主要富集于核酸结合相关条目。

图2. 差异甲基化基因(DMGs)的基因本体(GO)富集分析，包括每个分类前10个富集的GO项

3. 差异甲基化基因和差异表达基因的综合分析

为了揭示甲基化水平的变化是否改变睾丸和卵巢的DMGs表达，应用WGBS的相同样品进行RNA-seq，共鉴定得到11479个差异表达基因（DEGs）。对差异甲基化基因和差异表达基因进行整合分析，鉴定得到901个差异甲基化和表达相关基因（DMEGs）。这些DEMGs中，457个基因表现出DNA甲基化状态与表达水平负相关（图3. a）。对这些基因进行GO富集分析，所有显著富集GO项属于生物工程类，包括减数细胞周期、减数分裂I细胞周期过程、生殖、生殖过程、减数分裂细胞周期过程和错配修复（图3. b）。

图3. 差异甲基化基因和差异表达基因综合分析

基于已报道的文献资料，作者筛选出16个参与性腺发育的DMEGs（表2）。

表2. 参与性腺发育的16个DEMG的信息

4. 候选基因甲基化和表达水平的验证

8个DMEGs被选出来进行BS-PCR和qRT-PCR，验证它们的甲基化水平和表达水平。有7个基因在睾丸中有较低的甲基化水平、较高的表达水平，它们是：piwil1、tdrd1、socs2、dnmt3a、nanos2、sox30和mei4（图4）。这些结果与亚硫酸盐全基因组测序和转录组测序数据基本一致，说明本研究的高通量测序数据是可靠的。

图4. 选定基因的甲基化和表达水平分析

总 结

通过联合全基因组甲基化和基因表达分析，该研究发现黄鳝从雌性到雄性的过程中启动子区域甲基化水平升高，16个性腺发育候选基因的甲基化和表达发生改变。这一研究有助于进一步认识黄鳝性反转的分子机制。

延伸思考

DNA甲基化可以在不改变DNA序列的条件下调控基因的表达，目前已有大量的研究围绕DNA甲基化和基因表达展开。DNA甲基化涉及的生物学领域较为广泛，比如生长发育、疾病的发生、癌症机制、植物抗逆等。

本次分享的客户文章提供了DNA甲基化和转录组联合分析的一种思路，首先对甲基化组和转录组进行统计分析，找到差异甲基化基因和差异表达基因，然后进行GO富集分析；第二，对两者的数据进行联合分析，再借助相关领域的文献资料查找目标基因；最后，利用分子生物学手段对相关的结果进行验证。这个思路值得从没做过甲基化分析的老师参考。

文献下载

通过对月季的转录组比较分析，可以了解盐胁迫应答的关键因素和信号通路.pdf