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武汉爱基百客生物科技有限公司(简称爱基百客),注册于2014年12月31日,次年10月正式开始对外运营,是一家专业提供表观组学技术服务、高通量测序、单细胞测序分析的新型生物科技服务企业。

公司总员工已达到百余人,其中95%以上具有学士学位,40%以上具有硕士及以上学位,专职科研人员20余人,专职销售人员30余人,覆盖全国90%的省市,核心成员来自国内知名高效、基因测序公司、信息分析公司等。

公司运营至今销售额累积1亿左右,成为国内成长最迅速的二代测序与生物科研服务企业之一。




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什么是单细胞测序?

  如何进行单细胞测序


  目前有两种实现单细胞测序的策略。

单细胞测序


  首先也就是现在大多数人认为的,分离单个细胞,独立构建测序库,后面进行测序的路径。我们可以通过流式细胞术(包括微流体芯片)或激光捕获显微切割(LCM)来完成。流式细胞术估计大家都比较熟悉,就不多说了,主要用于细胞样品。对于组织切片样品,主要通过LCM获得单细胞。


  但是分离单细胞,分别进行库测序,因为流通量很低,所以主要受成本限制。随着单细胞数量的增加,碱基测序成本也将几乎线性上升。通常制造十几个细胞要烧掉很多钱。但是这几十个细胞足以说明问题吗?


  为了克服这一困难,近年来采取了很多基于二个战略barcode的单细胞识别。它的主要想法是在每个细胞中添加的DNA序列,对序列进行排序时,将具有相同barcode的序列视为来自同一个细胞。(阿尔伯特爱因斯坦,Northern Exposure(美国电视),细胞名言)这种策略可以一次建立仓库,测量数百个单细胞信息。


  但是,对于特定的测序类型,在细胞中添加barcode的方案有不少差异。对转录组MRNA(RNA)来说,更容易理解。因为在MRNA测序前要进行逆转录,所以只需在poly T引物的5’末放入barcode即可。


  首先,将含有单细胞悬液样品和barcode的明胶珠通过微流体芯片包裹在油滴中。在油滴中进行反转录后,单细胞cDNA文库多带来了独特的barcode(蓝色部分)。我们混合所有单细胞cDNA文库进行测序,然后通过程序识别barcode来区分单细胞。


  如果测序对象是与整个基因组相同的DNA,则需要用其他方法添加barcode。目前主要通过改造后的高质量转氨酶(transposase)Tn5实现。


  基因转换位点是指转座子DNA从一个染色体位置“跳跃”到另一个位置的过程。在这个过程中,有变性人拉杰的参与。单细胞DNA碱基序列利用这一特性预先组装barcode DNA和旋转酶Tn5,然后通过上述微流体技术将细胞和旋转石复合物包裹在油滴中。之后,转氨酶将barcode插入基因组DNA。这个过程在文献中也成为了tagmentation。但是,基于Tn5的barcode复杂性(即有多少独特的barcode)仍然有限。为了确保Tagmentation的效率,上图中的红色barcode区域不能太长。同时,为了避免因测序错误而产生的错误认识(例如偶尔测错碱,但被认为是另一个barcode),barcode的复杂性也没有4的N次方那么高,因此需要引入校正机制。我不具体说了。一般来说,单细胞只用Tn5制成,一次只能识别几十到几百个单细胞。


  为了提高复杂性,即一次能抓住的单细胞数量,目前的解决方案是采取组合索引(combinatorial indexing)路径。


  它的主要想法是通过两个阶段的反应贴上两个标签。首先将单细胞悬液放入多孔板中,使用旋转酶Tn5向细胞添加优先barcode。其中,每个孔的barcode是不同的。然后混合样本,通过流式细胞术将少量细胞分类到含有库PCR引物的多孔板中。而这些引物有二轮的barcode。因此,在Tn5的旋转石和PCR上贴上标签,大多数细胞都能带来独特的barcode。


  读到这里,肯定有人发现了这个方案中存在的问题。例如,如果从一个孔中分离出两个或更多橙色细胞,通过PCR贴上红色标签,则两个单细胞无法区分。


  实际上,combinatorial indexing的碰撞率约为百分之10。也就是说,大约百分之10的机会可以误认为两个单细胞是同一个。这个数字的高低取决于一阶段tagmentation的复杂性(复杂性越高,碰撞率越低)和分类时分配给每个孔的细胞数(数字越低,碰撞率越低)。但是,combinatorial indexing一次可以识别数千个单细胞,使通量提高数十亿倍以上。鱼和熊掌取决于实验者的取舍。


  为什么要使用单细胞测序?


  世界上没有两片相同的叶子。对多细胞生物来说,细胞和细胞之间存在差异。当然,这个差别可能很小。


  例如,受精卵从一个细胞开始分裂,形成囊胚,终成长为个体时,细胞和细胞的差异会越来越大。有的分化为神经元,有的分化为骨骼肌,各自表达不同的遗传信息,承担不同的生理功能。此外,还有遗传信息的不同,如肿瘤组织中以肿块为核心的细胞、肿块周围的细胞、淋巴转移炉中的细胞、远程转移的细胞、基因组、转录组等。这种差异在临床上可以决定这个肿瘤对什么治疗方法有效。


  这就是所谓遗传信息的异质性。


  传统的研究方法是在多细胞水平上进行的。因此,则终信号值实际上是多个细胞的平均值,异构信息丢失。


  为了检测某种蛋白质的表达量,我们可以通过Western blot和流式细胞术来实现。但是,使用Western blot不能区分目标蛋白质是仅在细胞的百分之10中表达强烈,还是在细胞的百分之50中表达中等,还是在所有细胞中表达软弱。因为电动游泳跑出来,所以几乎是强度的属相。但是,在单细胞水平测量荧光强度的流式细胞术这一技术可以区分这种情况。


  同样,单细胞测序可以检测混合样本测序中无法获得的异质性信息。这将使整个遗传学领域进入一个新的水平。


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