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武汉爱基百客生物科技有限公司(简称爱基百客),注册于2014年12月31日,次年10月正式开始对外运营,是一家专业提供表观组学技术服务、高通量测序、单细胞测序分析的新型生物科技服务企业。

公司总员工已达到百余人,其中95%以上具有学士学位,40%以上具有硕士及以上学位,专职科研人员20余人,专职销售人员30余人,覆盖全国90%的省市,核心成员来自国内知名高效、基因测序公司、信息分析公司等。

公司运营至今销售额累积1亿左右,成为国内成长最迅速的二代测序与生物科研服务企业之一。




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文献解读 | 外泌体circLPAR1通过METTL3-eIF3h相互作用抑制BRD4在结直肠癌诊断和肿瘤发生中发挥作用

前期我们通过一篇综述表明了外泌体circRNA在癌症/肿瘤监测、治疗中的重要性,本次向大家展示这篇来自Molecular cancer(IF=27.401)的文献是如何利用表观技术手段对肿瘤外泌体circRNA进行研究的,以期能够为各位老师提供对应的研究思路。

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文章标题:Exosomal circLPAR1 functions in colorectal cancer diagnosis and tumorigenesis through suppressing BRD4 via METTL3–eIF3h interaction

研究背景

结直肠癌已成为消化系统最常见的恶性肿瘤之一,到2020年,全球估计有超过190万例新发结直肠癌病例和935,000例死亡。近年来,我国结直肠癌的发病率和死亡率居高不下。尽管一些方法已应用于临床,包括结肠镜检查、乙状结肠镜检查和基于粪便的检测,但结直肠癌的早期发现和诊断仍然具有挑战性。因此,迫切需要鉴定结直肠癌的新型生物标志物。外泌体已成为多种癌症的重要生物标志物,并含有丰富的环状RNA(circRNA)。然而,外泌体circRNA用于诊断的潜力及其在结直肠癌(CRC)中的分子作用机制仍不清楚。

研究技术

RNA-seq;circRNA Pulldown;蛋白组学分析;RIP-qPCR;动物实验。

技术路线

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研究结果

一、下调的circLPAR1被包裹在结直肠癌的外泌体中


为了表征结直肠癌中失调的circRNA,作者在52对结直肠肿瘤和正常邻近组织(NAT)中进行了RNA-Seq,并观察到了14,221个circRNA。通过筛选,作者获得了5个circRNA(hsa_circ_0019223、hsa_circ_0007379、hsa_circ_0077837、hsa_circ_0087960和hsa_circ_0109301),与在NAT中的表达相比,它们在结直肠肿瘤组织中的表达显著降低。随后,作者使用exoRBase数据库对外泌体中的circRNA进行注释,并对来自NAT和结直肠癌的血浆外泌体以及结直肠癌细胞系进行circRNA的含量检测,最终发现hsa_circ_0087960(源自LPAR1,以下称为circLPAR1)在结直肠癌外泌体中表达,并在结直肠癌细胞系(HCT116和DLD1)中表达显著下调。

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二、CircLPAR1在结直肠肿瘤中下调并与总生存期相关


CircLPAR1由位于chr9(113734352-113735838)上的LPAR1基因的外显子3和外显子4环化产生,长226bp,具有“头对尾”反向剪接位点。为了可视化circLPAR1的表达模式,作者使用包含79对结直肠肿瘤和NAT的组织微阵列进行了FISH测定,发现circLPAR1主要在细胞质中表达和定位。此外,当根据circLPAR1的中位表达对结直肠癌患者进行分层时,对数据的Kaplan-Meier分析表明,具有高circLPAR1水平的结直肠癌患者的总生存期明显优于那些患者。

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三、血浆外泌体circLPAR1是结直肠癌诊断的特异性生物标志物


考虑到外泌体中circLPAR1的检测及其在结直肠肿瘤中下调的表达模式,作者推测circLPAR1是否由血浆外泌体携带并可作为结直肠癌的特异性生物标志物。


作者对来自无癌对照、息肉患者、结直肠癌患者的外泌体circLPAR1进行了表达检测,发现结直肠癌外泌体显著低于无癌对照组和息肉患者,表明在从癌前病变到癌症的疾病发展过程中,外泌体circLPAR1可能会降低。此外,结直肠肿瘤切除后外泌体circLPAR1水平显著升高。ROC曲线显示,外泌体circLPAR1能够区分结直肠癌患者和无癌对照个体,并且AUC高于CEA和CA19-9(两种广泛用于结直肠癌诊断的临床生物标志物),外泌体circLPAR1、CEA和CA19-9的组合能够增加结直肠癌诊断的敏感性和特异性。


为了证明外泌体circLPAR1对结直肠癌细胞的作用,作者探索了外泌体circLPAR1在结直肠肿瘤发生中的生物学功能。作者将circLPAR1-Exos进行了荧光标记,荧光显微镜显示HCT116和DLD1细胞的细胞质中存在PKH67绿色荧光染料,而非Exos组中未观察到PKH67绿色荧光染料,表明HCT116/DLD1-Exos被结直肠癌细胞迅速吞噬。细胞功能实验表明外泌体circLPAR1显著抑制了结直肠癌细胞的增殖、集落形成、侵袭和迁移。


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四、外泌体circLPAR1通过与eIF3h相互作用调节BRD4水平来抑制结直肠癌的肿瘤发生


为了探究外泌体circLPAR1影响结直肠癌的分子机制,作者进行了circRNApull-down和蛋白质组学检测,通过质谱分析和catRAPID发现eIF3h与circLPAR1的结合能力最强,并通过共定位实验和RIP-qPCR验证了外泌体circLPAR1直接与eIF3h相互作用。最近的一项研究报告称,eIF3h与甲基转移酶样3(METTL3)之间存在直接的物理和功能相互作用,可调节含溴结构域蛋白4(BRD4)的翻译并影响肿瘤发生。因此,作者想知道外泌体circLPAR1是否可以作为eIF3h的海绵来影响BRD4蛋白的表达。结果发现,与NC组相比,circLPAR1的存在降低了转染circLPAR1慢病毒载体或与circLPAR1-Exos孵育的结直肠癌细胞中的BRD4蛋白水平,暗示了外泌体circLPAR1能够通过与eIF3h相互作用来调节BRD4水平。

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五、外泌体circLPAR1抑制体内结直肠癌生长


为了验证体内外泌体circLPAR1在结直肠癌中的抑制作用,作者将稳定的circLPAR1/NC过表达细胞注入人源化NCG小鼠,对小鼠的肿瘤表型、实时成像和IHC分析表明circLPAR1过表达或circLPAR1-Exos治疗降低了肿瘤的平均大小和重量。

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结论:


在这项研究中,作者鉴定了一种新的circRNA,circLPAR1,它稳定地携带在血浆外泌体中,并成为一种潜在的结直肠癌特异性诊断生物标志物。机制上,外泌体circLPAR1被结直肠癌细胞内化并结合eIF3h以减少METTL3-eIF3h依赖的mRNA翻译,从而抑制BRD4表达并抑制细胞增殖、侵袭和迁移。该研究不仅报道了外泌体circRNA在结直肠癌中的新机制,而且为结直肠癌的筛查策略和诊断方法开辟了新途径。


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