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客户文章 | 重复干旱条件下亚麻籽抗旱性的转录组分析及其分子机制
发表单位：中国农业科学院油料作物研究所 发表日期：2021年2月9日 期 刊：BMC Genomics（IF:4.547） 2021年2月9日，中国农业科学院油料作物研究所严兴初研究员课题组在杂志 BMC Genomics（IF: 4.547）发表题为“Transcriptome analysis and molecular mechanism of linseed (Linum usitatissimum L.) drought tolerance under repeated drought using single-molecule long-read sequencing”的研究论文。该研究利用 single-molecule long-read sequencing技术在全基因组范围内比较分析不同抗旱性亚麻籽品种在不同干旱处理下的基因表达模式的研究。
研究背景 亚麻(Linum usitatissimum L.)是我国重要的油料作物之一，它含有对人体有益的不饱和脂肪酸和植物激素。干旱胁迫(DS)是最普遍的限制作物生产力的环境因素，可直接导致平均产量损失超过50%，全球气候变化正在增加严重干旱条件发生的频率。气候变化导致的干旱增加使亚麻仁的产量和品质显著下降。但在全基因组水平上，亚麻籽如何协调抗旱基因的表达以应对不同水平的干旱胁迫(DS)却知之甚少。 研究思路
研究结果 1. 亚麻籽品种耐旱性的测定 在该研究中，作者在干旱条件下测定了品种Z141和NY-14的3个耐旱指标（株高、生物量减少速率、叶片相对含水量）。Z141品种在干旱条件下一直比NY-17品种表现更好。利用统计学分析确定品种Z141的耐旱性更强。于是作者利用单分子长读转录组测序技术去分析Z141和NY-17响应干旱的分子机制差异。采用RNA-Seq reads和公共的flax序列重新构建转录组数据，对数据进行质控和校正，该研究获得了一个1093282高质量FLNC序列。
图1 亚麻籽耐旱性鉴定 2. 干旱和重复干旱相关转录组的全局比较，揭示基因表达和功能组的差异 作者采用主成分分析(PCA)比较了亚麻籽的mRNA群体，为进一步理解对亚麻籽基因响应干旱的调控机制提供了一个参考标准。在DS（干旱胁迫）、RS（复水）和RD（重复干旱）条件下，Z141和NY-17的转录组在基因表达上可能有很大的相似性，远离对照组。另外，作者还对差异表达基因进行了聚类分析。这部分结果证明DS和RD的转录组存在功能差异。另外，作者还对差异候选基因进行GO富集分析。研究表明，干旱胁迫下亚麻籽脯氨酸生物合成基因显著上调。
图2 干旱和重复干旱处理下亚麻籽幼苗叶片转录组谱的比较分析
图3 GO富集分析 3. Z141和NY-17品种比较转录组反映亚麻籽耐旱的分子机制 虽然Z141和NY-17的转录组在整体表达上非常相似，但在DS胁迫下，一系列应激响应基因的表达模式发生了改变，表明不同功能类别的基因可能会影响亚麻籽的耐旱性。作者对DS和RD条件下的重叠上调和下调基因进行统计分析，还对特异上、下调的差异基因进行统计分析。 4. REVIGO分析 为了去除不显著的GO项以及可视化品种Z141和NY-17基因型的GO差异，作者提交了上调和下调富集GO分类进行REVIGO分析。REVIGO分析表明，RD胁迫下Z141和NY-17的富集GO项比DS胁迫下更相似。DS和RD胁迫条件下，Z1411和NY-17中都下调的GO项主要是四吡咯生物合成、光合作用和光反应。这一结果与GO分析结果一致，表明DS对亚麻籽地上部分的影响主要涉及光合作用。
5. 利用MapMan分析差异基因的功能 作者利用MapMan来分析干旱对亚麻籽叶片组织的影响和变化。MapMan分析结果显示上、下调差异基因主要富集的功能组和通路与GO富集分析一致。
图6 干旱胁迫下Z141和NY-17干旱胁迫响应的差异基因MapMan可视化 6. PPI网络分析 为了进一步探索干旱过程中蛋白质的相互作用，作者构建了所有上调和下调差异基因的PPI网络，并利用STRING程序在亚麻籽叶组织中对它们进行了鉴定。在这个网络分析中，作者确定RAD50 (DNA修复蛋白50)相互作用蛋白1(RIN-1)是一个与脯氨酸生物合成和应激反应相互作用的中心基因。下调差异基因中，有94个节点蛋白带有PPI富集。几乎所有的节点聚焦于光合作用或相关的调控网络上。
图7 利用RNA-Seq分析鉴定胁迫应答基因的相互作用网络 7. 鉴定相应干旱和重复干旱的瞬时上调和下调转录因子 为了了解DS和RD处理过程中调控过程的本质，作者分析了转录因子。共有来自50个家族的4936个亚麻籽TF基因被鉴定到。11个家族约占应激反应TF基因的一半，包括bHLH (9%)、C2H2 (8%)、NAC (8%)、MYB(6%) 、ERF (6%)、bZIP (5%)、 WRKY (5%) 和 MYB相关的 (4%)。根据表达模式将1190个TFs划分为15个簇，有几个簇是植物逆境反应通路的关键调节子。
图8 干旱和重复干旱相应转录因子簇 8. 候选基因预测 通过前面的GO富集、MapMan、PPI网络分析以及基因注释，作者从差异基因（与脯氨酸合成、逆境胁迫等有关）中筛选到一些干旱响应基因作为候选基因。对这些候选基因的表达模式进行分析，最终24个基因（8个P5CS基因家族成员、2个P5CR基因家族成员、8个DNA修复基因和6个脱水蛋白编码基因）筛选出来作为最有可能的干旱候选基因。
图9 P5CS和P5CR基因家族成员的基因表达水平 9. RT-PCR验证 从转录组数据中选择与DNA修复、MAPK信号通路、脯氨酸生物合成和光合作用相关的差异表达候选基因，通过RT-PCR进行验证。结果(下图)显示，所选基因的转录丰度与转录组分析结果一致，从而验证了转录组数据在未来研究中的可靠性。
图10 RT-PCR验证差异表达基因 总结在干旱胁迫下，只有耐旱性较好的亚麻籽品种的一群与植物耐旱性相关的基因被上调。此外，在重复干旱条件下，更多的基因参与了亚麻仁对干旱胁迫的响应。这是第一个利用单分子长读测序技术在全基因组范围内比较分析不同抗旱性亚麻籽品种在不同干旱处理下的基因表达模式的研究。 往期推荐：
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