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客户文章 | 全基因组鉴定揭示水稻稻曲病形成的分子机制
发表单位：华中农业大学 发表日期：2021年11月10日 期 刊：J. Fungi（IF:5.724） 2021年11月10日，华中农业大学植物病理学湖北省重点实验室黄俊斌教授团队在期刊J. Fungi（IF:5.724）发表题为“Genome-Wide Identification and Functional Characterization of CCHC-Type Zinc Finger Genes in Ustilaginoidea virens”的研究论文。该研究对水稻稻曲病菌全基因范围的CCHC型锌指蛋白基因进行了分析，构建相关基因的突变体进行表型、生长速率和RNA-seq等分析，揭示了水稻稻曲病孢子球形成的机制。爱基百客为该研究提供RNA-seq的技术支持。
研究背景 由稻曲病原真菌（Ustilaginoidea virens）引起的水稻稻曲病是一种严重的水稻病害，目前已成为世界上大多数水稻种植区的病害。水稻稻曲病除造成产量损失外，还会在稻曲病孢子球中产生环肽真菌毒素，威胁人类和动物健康。通过对U. virens和其他丝状子囊菌的基因组比较分析，预测U. virens具有超过300个转录因子。但迄今为止，只有少数被表征出来，大部分转录因子的作用尚不清楚。在本研究中，作者对U. virens中CCHC型锌指蛋白进行了全基因组鉴定和功能分析。 研究材料 稻曲病野生型菌株HWD-2 研究思路
研究结果 1. 水稻稻曲病CCHC型锌指蛋白的鉴定 基于保守的CCHC-box结构域“-C-X2-C-X4-H-X4-C-”，作者鉴定到7个CCHC型锌指蛋白基因。系统进化分析显示这些蛋白在丝状真菌中保守（图1A）。鉴定出7个编码蛋白质的基因，包含1 ~ 7拷贝的保守CCHC box，表明该真菌中存在7个CCHC型锌指蛋白（图1B）。作者利用酵母单杂检测这些蛋白的转录活性（图1C）。结果表明UvCCHC3、UvCCHC4、UvCCHC5和UvCCHC7在稻曲病菌中行使转录因子的功能。
图1 稻曲病菌种CCHC锌指蛋白鉴定。 2. 稻曲病中CCHC型锌指基因的表达模式 为了调查这些转录因子的功能，作者通过RT-PCR检测UvCCHC基因在稻曲病菌不同侵染时期的表达模式（图2）。结果表明UvCCHC基因在稻曲病菌早期侵染时期扮演重要作用。
图2 稻曲病菌UvCCHC基因的表达 3. UvCCHC基因对稻曲病菌丝生长与分生孢子生产非常重要 作者构建了UvCCHC基因敲除突变体。为了确认UvCCHC基因是否与菌丝生长有关，作者检测了野生型菌株HWD-2、∆UvCCHC突变体和互补菌株在PSA培养基上的生长速率（图3）。结果显示UvCCHC1、UvCCHC3和UvCCHC4是菌丝生长所必需的，UvCCHC5、UvCCH6和UvCCHC7在分生孢子生产中扮演重要作用。
图3 UvCCH基因缺失影响菌丝生长和孢子生出 4. UvCCHC基因在稻曲病对环境胁迫的响应中起关键作用 为了探讨UvCCHC基因在稻曲病菌对环境胁迫适应中的作用，作者比较HWD-2、∆UvCCHC突变体和互补菌株在包含不同胁迫试剂PSA培养基的辐射生长速率。这些结果暗示UvCCHC基因调控U. virens对渗透胁迫和氧化胁迫的反应，以及其细胞壁完整性。
图4 ∆UvCCHC突变体对各种胁迫都很敏感 5. UvCCHC基因在稻曲病毒力中起重要作用 为了探索UvCCHC基因在稻曲病菌感染中的作用，作者将HWD-2、∆UvCCHC突变体和互补菌株感染敏感水稻品种Wanxian-98检测毒力。经过21 dpi后，作者观察到HWD-2和互补菌株侵染的水稻小穗上约有62个稻曲病孢子球，∆UvCCHC1、∆UvCCHC2和∆UvCCHC3侵染的水稻小穗上约有60个稻曲病孢子球。∆UvCCHC6和∆UvCCHC7的致病力显著高，侵染后的水稻小穗产生了90多个稻曲病孢子球。与之相比，∆UvCCHC4和∆UvCCHC5突变体的毒力显著减少，因为∆UvCCHC4突变体仅在水稻颖花上产生约24粒稻曲病孢子球，∆UvCCHC5突变体未能产生到稻曲病孢子球（图5）。
图5 UvCCHC基因是稻曲病菌毒力所必需的 6. UvCCHC5调控稻曲孢子球的形成 尽管∆UvCCHC5突变体未能产生稻曲病孢子球，这些突变体能侵染水稻花器官。作者观察HWD2和∆UvCCHC5-23突变体侵染过程的细节（图6A）。在3 dpi时，菌丝沿小穗表面伸长和延伸。在5 dpi下，侵染水稻的菌丝表面出现菌丝。15 dpi时，∆UvCCHC5-23侵染的水稻籽粒不含球形菌落，而HWD-2侵染的水稻籽粒形成稻曲球（图6A）。上述结果表明，∆UvCCHC5-23成功地与水稻小穗建立了营养关系，但未形成稻曲球。
图6 UvCCHC5是调控水稻稻曲病球形成的关键转录因子 7. UvCCHC5缺失不影响与籽粒灌浆有关的水稻基因表达 作者推测不像野生型HWD-2，突变体∆UvCCHC5-23不能诱导籽粒灌浆基因的表达，因此不能获取大量营养，阻止稻曲球的形成。为了验证这个推论，作者检测接种∆UvCCHC5-23或HWD-2后不同侵染时期水稻籽粒灌浆基因的表达。籽粒灌浆相关基因（包括OsSSIIIa、OsRISBZ1、OsBEIIb、OsAGPS2b、OsSSI、OsPromln2、 OsAGPL2和OsGlutln3）的表达水平类似于接种∆UvCCHC5-23和HWD-2的水稻小穗（图6B-I）。这些结果暗示∆UvCCHC5缺失不影响水稻籽粒灌浆相关基因的表达。因此，∆UvCCHC5-23未能诱导稻曲病球形成可能是由于病原菌发育不足所致。 8. UvCCHC5在糖利用、碳水化合物运输和跨膜运输中扮演重要作用 作者比较∆UvCCHC5-23和∆UvCCHC5-43与HWD-2和互补菌株C∆UvCCHC5-23的碳水化合物利用偏好。在包含不同糖类（蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、水苏糖、棉子糖、海藻糖、可溶性淀粉）的Czapek-Dox培养基上菌株生长5mm菌丝。与HWD-2比较，生长在葡萄糖、蔗糖、乳糖、水苏糖和海藻糖的突变体∆UvCCHC5-23生长速率显著减少，这暗示突变体在这些糖类利用时存在缺陷（图7A和B）。 作者此前的研究结果证明转录因子UvCom1在控制稻曲病球形成中扮演重要角色。作者调查UvCCHC5是否与UvCom1有相同的功能。UvCom1调控涉及运输活性、跨膜运输、碳水化合物运输和代谢基因的表达。作者利用RT-PCR监测菌丝中涉及跨膜运输和糖转运的基因表达水平，结果发现这些基因在突变体∆UvCCHC5-23中显著下降（图7C）。
图7 ∆UvCCHC5突变体在利用不同糖类时存在缺陷 9. 全基因组范围鉴定由UvCCHC4调控的基因 为了调查转录因子UvCCHC4的调控机制，作者做了RNA-seq分析比较侵染HWD-2 vs ∆UvCCHC4-1突变体3dpi的小穗的表达谱。基于log2（∆UvCCHC4-1/HWD-2）>2，鉴定到810个差异表达基因，652个下调和158个上调（图8A）。很多差异表达基因富集GO项目在核糖体、翻译、核糖体、核仁和rRNA结合（图8C）。KEGG分析显示很多差异表达基因富集在线粒体生物合成 ，核糖体、转运体和核糖体的生物合成（图8D）。为了验证RNA-seq的基因表达模式，作者选取10个基因做RT-PCR。结果显示它们的结果一致。这些结果暗示UvCCHC4在核糖体活性和转译中扮演重要角色。
图8 转录组分析∆UvCCHC4-1 vs HWD-2鉴定差异基因 10. 稻曲病菌的UvCCHC4和UvCCHC5亚细胞定位 最后，作者分析了UvCCHC4和UvCCHC5的亚细胞定位，共聚焦显微镜显示带有GFP信号的转化菌株在分生孢子和营养菌丝的核内观察到（图9A和B）。加上免疫印迹结果，结果暗示UvCCHC4和UvCCHC5定位于稻曲病菌的细胞核。
图9 稻曲病菌UvCCHC4和UvCCHC5的亚细胞定位 研究结论综上所述，本研究揭示了UvCCHC基因对稻曲病菌的胁迫反应、营养生长、产孢和毒力的影响。作者从该病原体中鉴定出一个重要的转录因子UvCCHC5。UvCCHC5是水稻稻曲病球形成的必要条件。∆UvCCHC5突变体正常侵染水稻小穗，但不能形成黑穗病球，失去了稳定利用水稻寄主养分的能力。糖利用试验表明，∆UvCCHC5突变体对葡萄糖、蔗糖、乳糖、水苏糖和海藻糖的利用均存在缺陷。这些发现促进了我们对稻曲病在水稻中形成稻曲病球的分子机制的理解。 往期推荐：
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