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客户文章 | 一种新型转录因子UvCGBP1调控稻曲病菌的发育和毒力
题 目：一种新型转录因子UvCGBP1调控稻曲病菌的发育和毒力 期 刊: Virulence 影响因子: 5.4 单 位: 华中农业大学 2021年12月12日华中农业大学农业微生物学国家重点实验室郑露团队在Virulence发表一篇名为“A novel transcription factor UvCGBP1 regulates development and virulence of rice false smut fungus Ustilaginoidea virens”的研究论文。作者在该研究中报道鉴定了一个新的C2H2转录因子，被注释为G-box结合蛋白，UvCGBP1的敲除影响了稻曲病菌的发育和毒力。作者通过ChIP-seq鉴定了800多个靶基因，并提供了UvCGBP1及其调控网络的全基因组结合图谱。通过功能分析表明，UvCGBP1介导的MAPK通路调控稻曲病菌的毒力。该研究结果为UvCGBP1在稻曲病菌介导的基因调控机制提供了新的思路。爱基百客为该研究提供了RNA-seq和ChIP-seq技术支持。
研究背景 稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)是中国、印度和东南亚地区乃至全球的一种毁灭性的粮食病害。比较基因组学和转录组学分析稻曲病的致病机理提供了许多重要信息，其中许多致病因子已被预测，包括Uvt3277、UvAc1、UvPdeH、SCRE1、SCRE2 (UV_1261)等。在Yarrowia lipolytica中，C2H2型锌指蛋白MHY1与STREs的G-box motif结合。在木霉菌中，C2H2锌指蛋白Seb1结合G-box motif在高渗透胁迫反应中的功能。在茄镰孢中，已经证实角化酶基因启动子中的G-box基序是维持角化酶基因转录基础水平所必需的。尽管有这些信息，关于G-box结合转录因子如何控制真菌感染的机制研究仍未被探索。 材料方法 U. virens野生型(WT)菌株、WT和转化菌株 。 ChIP-seq；RNA-seq；EMSA；酵母单杂交等。 研究思路
研究结果 1. U. virens中UvCGBP1的鉴定及亚细胞定位与表达模式 作者在U. virens侵染水稻的转录组数据中发现UvCGBP1显著上调。构建13种子囊菌属真菌的CGBP1同源物的系统发育树显示UvCGBP1与Pochonia chlamydosporia的CGBP1蛋白最为相似(图1 a)。功能域分析显示UvCGBP1包含两个保守的C2H2 -zinc finger结构域(图1b)。并进一步使用酵母单杂交实验证实UvCGBP1具有反式激活活性(图1c)。这表明UvCGBP1作为C2H2型锌指转录因子在子囊菌中具有特异性分布。通过亚细胞定位实验表明GFP-UvCGBP1定位于U. virens细胞核。通过qRT-PCR检测UvCGBP1在菌丝生长、产孢和侵染过程中不同阶段的表达谱。UvCGBP1的表达在产孢和感染过程中显著上调(图1e)。结果表明，UvCGBP1可能参与了绿僵菌孢子产生和小穗定殖的过程。
图1 稻曲菌中UvCGBP1基因的鉴定 2. UvCGBP1经水稻提取液和非生物胁迫诱导后高表达 作者通过测定UvCGBP1在不同非生物胁迫和水稻小穗/叶片提取物处理下的表达谱，发现水稻提取物，尤其是小穗提取物强烈诱导UvCGBP1转录水平(图1f)。此外，在NaCl渗透胁迫和氧化胁迫H2O2下，UvCGBP1表达上调(图1g)。这些结果表明，UvCGBP1可能被一些非生物胁迫和水稻提取物的暴露激活。 为进一步研究UvCGBP1的功能，作者构建了敲除UvCGBP1的突变体。通过PCR、RT-PCR或southern blot分析确认了敲除突变体UvCGBP1-33和UvCGBP-36以及互补菌株CΔUvCGBP1-33。在PSA或PSB培养基上培养后，与WT和CΔUvCGBP1-33菌株相比，ΔUvCGBP1的营养生长率和菌丝干重均显著降低(图2a,b,c)。ΔUvCGBP1的菌丝顶端细胞长度显著减少(图2d,e)。缺失UvCGBP1导致分生孢子产量显著下降(图2f)。 为了探究UvCGBP1对不同胁迫响应的调控作用，将突变株置于含CFW、NaCl、山梨醇、h2o2、SDS或CR的PSA培养基中培养(图2g)。结果表明，ΔUvCGBP1对NaCl、山梨醇、SDS或CFW等化学处理的敏感性较高，对H2O2的抗性较WT和CΔUvCGBP1-33突变体增强。这表明UvCGBP1参与了渗透、氧化和细胞壁完整性胁迫的响应。
图2 缺失UvCGBP1会影响菌丝生长、产孢和各种胁迫反应。 3.UvCGBP1对U. virens小穗定殖和毒力具有重要作用 作者通过接种病菌水稻发现接种后21 d, WT每穗颖花上产生约50个假黑穗病球，CΔUvCGBP1-33每穗颖花上产生约35个假黑穗病球。相比之下，ΔUvCGBP1在水稻小穗上没有产生任何黑穗病球，并且完全丧失了致病性(图3a)。在植株侵染试验中，所有供试菌株在1dpi时均观察到大量菌丝在水稻小穗表面扩散。在6dpi时，WT或CΔUvCGBP1-33在水稻小穗内部空间发现菌丝，花丝完全侵染。相比之下，UvCGBP1突变体没有延伸到小穗，也没有在丝状物表面产生明显的菌丝(图3b)。结果表明，UvCGBP1对绿僵菌的毒力有重要影响。
图3 UvCGBP1对侵袭性生长和毒性具有重要作用 4. UvCGBP1调控毒力可能独立于角质酶 作者在U. virens基因组中发现4个角质酶基因(Uv8b_2652、Uv8b_7184、Uv8b_7527和Uv8b_8131)。与WT相比，在ΔUvCGBP1- 33中，Uv8b_2652和Uv8b_8131的表达显著下调，而Uv8b_7184的表达显著上调(图4a)。酵母单杂交结果显示，UvCGBP1与4个角化酶基因的启动子结合(图4b)。对其单独敲除发现单独缺失每个角化酶基因并不会导致异常的菌丝生长或致病性(图4c,d)。 接下来，作者评估了UvCGBP1-33的角化酶活性，发现在菌丝中它没有改变，但在四个角化酶基因缺失突变体中，每个突变体的活性都显著降低(图4e)。综上所述，这些结果表明UvCGBP1对毒力的调控可能独立于毒力靶标基因，提示UvCGBP1可能通过调控毒力靶标来调控毒力。
图4 UvCGBP1调控毒力可能独立于角质酶基因 5. UvCGBP1结合靶基因的全基因组鉴定 作者通过从 GFP-UvCGBP1靶株UvCGBP1-3进行ChIP-seq分析共鉴定出5126个峰，其中共有峰2900个到两个独立实验(图5a)。其中，74.52%的峰位于启动子区域 (图5b)。作者并通过转录起始位点(TSS)分析发现富集区域分布在整个U. virens基因组(图5 c)。KEGG富集分析显示最显著的功能通路为MAPK信号通路 (图5e)。 通过对已鉴定的峰进行MEME分析，发现一个UvCGBP1结合的DNA基序，以及一个C/AAGGGG基序、一个G/ AAAAAA基序、一个CTGCCCGCTGC基序、一个ATCCGTCGCAAT基序、一个CTACCGGGCTCA基序和一个TACGGAGTA基序组成了大部分UvCGBP1结合的DNA基序(图5f)。作者并用ChIP-qPCR实验验证5个靶基因Uv8b_1729、Uv8b_7791、UvPro1、UvPal1和UvCdc11的富集 (图5g) 。
图5 ChIP-Seq鉴定UvCGBP1的全基因组结合位点 6.对UvCGBP1的RNA-seq分析证实了UvCGBP1的靶基因和相关的生物学功能 作者通过RNA-seq比较WT和ΔUvCGBP1-33的整体基因表达模式发现在UvCGBP1-33突变体中有580个基因上调，494个基因下调。并通过RT-qPCR进行了验证。 通过ChIP-seq和RNA-seq数据联合分析，发现UvCGBP1的865个目的基因中有321个基因上调，255个基因下调；结果显示UvCGBP1既是转录激活因子又是转录抑制因子(图6a，b，c)。在这些上调和下调的靶基因中，约36%的这些基因的启动子中含有AGGGG motif(图6d)。EMSA结果显示UvCGBP1可以结合到该基序(图6e)。
图6 RNA-seq与ChIP-seq数据整合分析 6. UvCGBP1参与多种MAPK通路的调控 作者检测了UvCGBP1-33在13 dpi感染过程中UvPmk1和UvSlt2的表达谱，发现这两个基因在3 dpi的表达在ΔUvCGBP1突变体中显著降低(图7a)，并通过水稻敏感进行了UvPmk1-28和UvSlt2-2突变体的致病性和植株侵染试验。结果发现UvPmk1-28和UvSlt2-2突变体不能产生黑穗病球，且不致病(图7 b)。作者用抗p42/44 MAPK特异性抗体进行了检测。WB两个条带结果显示，UvCGBP1-33突变体中UvPmk1蛋白水平大幅下降，UvSlt2蛋白水平也略有下降(图7d)。这些结果提示，UvCGBP1的缺失降低了p42/44 MAPK的蛋白水平。 作者在ΔUvCGBP1-33突变体中过表达UvPmk1或UvSlt2发现过表达UvPmk1菌株的生长速度部分恢复，且显著高于UvCGBP1-33突变体(图7e,f)。与UvCGBP1-33相比，过表达UvPmk1菌株能在所有接种稻穗上形成黑穗病球，在患病穗上发现一些假黑穗病球(图7g,h,i)。UvCGBP1中过表达UvPmk1可恢复部分毒力。这些结果进一步证实了UvCGBP1通过调控MAPK通路影响稻曲菌的致病性。
图7 UvCGBP1通过介导MAPK通路调控毒力 小结 稻曲黑穗病菌(Ustilaginoidea virens，引起稻曲黑穗病)是一种经济上重要的子囊菌真菌病原菌，分布在世界各地的水稻种植区。作者在真菌中鉴定了一个新的转录因子UvCGBP1 (Cutinase G-box binding protein)，它是子囊菌所特有的。UvCGBP1基因的缺失影响U. virens的发育和毒力。 通过ChIP-seq鉴定UvCGBP1调控靶基因865个，其中最显著KEGG富集的功能通路为MAPK信号通路。大约36%的靶基因的启动子中含有AGGGG (G-box) motif。在靶标中，UvCGBP1的缺失影响了UvPmk1和UvSlt2的转录和翻译水平，这两者在毒力中都是重要的。 ChIP-qPCR、酵母单杂交和EMSA证实UvCGBP1可以结合UvPmk1或UvSlt2启动子。在ΔUvCGBP1-33突变体中过表达UvPmk1部分恢复了其毒力和菌丝生长，表明UvCGBP1可以调控真菌毒力的MAPK通路。综上所述，本研究揭示了一种新的真菌毒力调控机制，该机制与G-box结合转录因子UvCGBP1介导的MAPK通路有关。 往期推荐：
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