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客户文章 | Iso-seq、RNA-seq和ChIP-seq联合研究羊肉嫩度相关的新型异构体和可变剪接调控

发表单位：扬州大学

发表日期：2022年4月7日

期刊：Foods（IF:5.561）

2022年4月7日，扬州大学教育部农业与农产品安全国际联合研究实验室在期刊Foods（IF:5.561）发表题为“Preliminary Results about Lamb Meat Tenderness Based on the Study of Novel Isoforms and Alternative Splicing Regulation Pathways Using Iso-seq, RNA-seq and CTCF ChIP-seq Data”的研究论文。该研究以羊肉质不同的两个杂交品种（Dorper × Hu × Hu，DHH 和 Dorper × Dorper × Hu，DDH）为研究对象。联合Iso-seq、RNA-seq和CTCF ChIP-seq等技术，探讨了由CTCF调控的肉嫩度相关的新异构体，并揭示了选择性剪接产生异构体的可能调控机制。爱基百客为该研究提供ChIP-seq的技术支持。

研究背景

肉嫩度由几个内在因素(如蛋白水解活性、糖原量、纤维类型和结缔组织)和外在因素(如动物品种和营养条件)决定。在这些因素中，钙蛋白酶系统（calpain system）在肉的嫩度中起着重要的作用。此前有研究表明，CAPN3（Calpain3）蛋白和mRNA的表达水平与肉嫩度显著相关。此外，越多越多证据表明由于选择性剪接，从一个基因转录的不同异构体可能发挥不同的生物学作用。

PacBio长度亚型测序（Iso-seq），三代测序技术，它能直接获得全长的异构体。联合传统的RNA-seq，Iso-seq可以促进与复杂性状相关新异构体的鉴定。尽管差异表达基因的表达研究已经在绵羊的肉质性状中研究过，但是目前对绵羊肌肉中新型异构体的研究还很少。

研究材料

6只6月大公羊，3只Dorper ×Hu × Hu（DHH）和3只Dorper × Dorper × Hu （DDH）。

研究思路

实验总体设计。DEIs，差异表达亚型。

研究结果

1、肉的性状

在本研究中，屠宰后共测量了3个肉质性状。3个肉类性状的均值和标准差见表1。这些性状中，DDH品种的剪力显著高于DHH，其他肉类性状在DDH和DHH的性状没差异。

2、更新参考基因组注释文件

为了更新绵羊基因组注释(Generic Feature Format, GFF)，这对准确量化异构体丰度至关重要，作者汇集了6个RNA样本，实施Iso-seq测序。对基因位点、isoforms、可变剪接事件进行统计分析（图2）。

图2 鉴定得到CAST的异构体

3、差异表达异构体和功能分析

6份RNA-seq数据比对到更新的基因组注释文件，用以鉴定DDH和DHH之间的差异表达异构体。共鉴定到624个差异表达异构体。这624个差异表达异构体从492个基因转录而来，暗示一些基因可以产生超过1个差异表达异构体。

所有检测到的差异表达异构体显著富集于280个GO项；显著富集于17个KEGG通路（图4）。最重要的途径是胰高血糖素信号通路（ko049222）。

图3 差异表达异构体(DEIs)火山图

图4 差异表达异构体的功能注释

4、靶异构体的验证

为了验证差异表达异构体的结果，利用RT-PCR技术检测5个差异表达异构体（DEIs）。这5个异构体趋势与转录组数据一致。

图5 用qRT-PCR验证差异表达亚型

5、CTCF ChIP-seq

CTCF ChIP-seq选择两个肉质不同的肌肉样本。经过质量控制和比对，有一半以上的比对reads位于基因间区域（图6），其次是内含子、启动子、外显子、3’UTR和5’UTR。

在两个肉嫩度不同的样品检测到4388个差异peaks。差异峰数量最多分布在基因间的基因组区域，其次是内含子区域、启动子区域、外显子区域、5’UTR和3’UTR（图7）。作者还对这些差异峰的motif进行预测，共得到了66个motif。

图6 CTCF染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)在绵羊基因组中的reads分布

图7 差异峰在羊基因组上的分布

6、DEIs和差异Peaks的重叠

为了调查CTCF在羊肌肉组织中调控可变剪接的作用，对转录DEIs中的基因与位于差异peaks中的基因进行重叠分析。共找到了86个重叠基因（图8）

图8 差异peaks中的基因和转录差异表达异构体的基因的韦恩图

研究结论

在该研究中，DDH和DHH之间共鉴定到624个DEIs。比如，转录于CAPN3 异构体7.524.18可能与肉嫩度有关。转录DEIs与CTCF ChIP-seq得到的差异峰重叠基因有86个。这些重叠中，ANKRD23产生不同的异构体，可能受甲基化介导的CTCF调控。作为初步研究，研究结果发现了与肉嫩度相关的新型异构体，并通过生物信息学分析揭示了选择性剪接产生亚型的可能调控机制。

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