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武汉爱基百客生物科技有限公司(简称爱基百客),注册于2014年12月31日,次年10月正式开始对外运营,是一家专业提供表观组学技术服务、高通量测序、单细胞测序分析的新型生物科技服务企业。

公司总员工已达到百余人,其中95%以上具有学士学位,40%以上具有硕士及以上学位,专职科研人员20余人,专职销售人员30余人,覆盖全国90%的省市,核心成员来自国内知名高效、基因测序公司、信息分析公司等。

公司运营至今销售额累积1亿左右,成为国内成长最迅速的二代测序与生物科研服务企业之一。




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客户文章 | Iso-seq、RNA-seq和ChIP-seq联合研究羊肉嫩度相关的新型异构体和可变剪接调控

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发表单位:扬州大学
发表日期:2022年4月7日
期    刊:Foods(IF:5.561)


2022年4月7日,扬州大学教育部农业与农产品安全国际联合研究实验室在期刊Foods(IF:5.561)发表题为“Preliminary Results about Lamb Meat Tenderness Based on the Study of Novel Isoforms and Alternative Splicing Regulation Pathways Using Iso-seq, RNA-seq and CTCF ChIP-seq Data”的研究论文。该研究以羊肉质不同的两个杂交品种(Dorper × Hu × Hu,DHH 和 Dorper × Dorper × Hu,DDH)为研究对象。联合Iso-seq、RNA-seq和CTCF ChIP-seq等技术,探讨了由CTCF调控的肉嫩度相关的新异构体,并揭示了选择性剪接产生异构体的可能调控机制。爱基百客为该研究提供ChIP-seq的技术支持

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01

研究背景


肉嫩度由几个内在因素(如蛋白水解活性、糖原量、纤维类型和结缔组织)和外在因素(如动物品种和营养条件)决定。在这些因素中,钙蛋白酶系统(calpain system)在肉的嫩度中起着重要的作用。此前有研究表明,CAPN3(Calpain3)蛋白和mRNA的表达水平与肉嫩度显著相关。此外,越多越多证据表明由于选择性剪接,从一个基因转录的不同异构体可能发挥不同的生物学作用。
PacBio长度亚型测序(Iso-seq),三代测序技术,它能直接获得全长的异构体。联合传统的RNA-seq,Iso-seq可以促进与复杂性状相关新异构体的鉴定。尽管差异表达基因的表达研究已经在绵羊的肉质性状中研究过,但是目前对绵羊肌肉中新型异构体的研究还很少。

02

研究材料


6只6月大公羊,3只Dorper ×Hu × Hu(DHH)和3只Dorper × Dorper × Hu (DDH)。


03

研究思路


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实验总体设计。DEIs,差异表达亚型。

04

研究结果


 1、肉的性状

在本研究中,屠宰后共测量了3个肉质性状。3个肉类性状的均值和标准差见表1。这些性状中,DDH品种的剪力显著高于DHH,其他肉类性状在DDH和DHH的性状没差异。

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2、更新参考基因组注释文件


为了更新绵羊基因组注释(Generic Feature Format, GFF),这对准确量化异构体丰度至关重要,作者汇集了6个RNA样本,实施Iso-seq测序。对基因位点、isoforms、可变剪接事件进行统计分析(图2)。

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图2 鉴定得到CAST的异构体

3、差异表达异构体和功能分析


6份RNA-seq数据比对到更新的基因组注释文件,用以鉴定DDH和DHH之间的差异表达异构体。共鉴定到624个差异表达异构体。这624个差异表达异构体从492个基因转录而来,暗示一些基因可以产生超过1个差异表达异构体。

所有检测到的差异表达异构体显著富集于280个GO项;显著富集于17个KEGG通路(图4)。最重要的途径是胰高血糖素信号通路(ko049222)。

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图3 差异表达异构体(DEIs)火山图


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图4 差异表达异构体的功能注释

4、靶异构体的验证

为了验证差异表达异构体的结果,利用RT-PCR技术检测5个差异表达异构体(DEIs)。这5个异构体趋势与转录组数据一致。

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图5 用qRT-PCR验证差异表达亚型

5、CTCF ChIP-seq


CTCF ChIP-seq选择两个肉质不同的肌肉样本。经过质量控制和比对,有一半以上的比对reads位于基因间区域(图6),其次是内含子、启动子、外显子、3’UTR和5’UTR。
在两个肉嫩度不同的样品检测到4388个差异peaks。差异峰数量最多分布在基因间的基因组区域,其次是内含子区域、启动子区域、外显子区域、5’UTR和3’UTR(图7)。作者还对这些差异峰的motif进行预测,共得到了66个motif。

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图6 CTCF染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)在绵羊基因组中的reads分布


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图7 差异峰在羊基因组上的分布


6、DEIs和差异Peaks的重叠

为了调查CTCF在羊肌肉组织中调控可变剪接的作用,对转录DEIs中的基因与位于差异peaks中的基因进行重叠分析。共找到了86个重叠基因(图8)

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图8 差异peaks中的基因和转录差异表达异构体的基因的韦恩图

05

研究结论


在该研究中,DDH和DHH之间共鉴定到624个DEIs。比如,转录于CAPN3 异构体7.524.18可能与肉嫩度有关。转录DEIs与CTCF ChIP-seq得到的差异峰重叠基因有86个。这些重叠中,ANKRD23产生不同的异构体,可能受甲基化介导的CTCF调控。作为初步研究,研究结果发现了与肉嫩度相关的新型异构体,并通过生物信息学分析揭示了选择性剪接产生亚型的可能调控机制。

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