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客户文章 | Plant Commun华南农大刘耀光院士团队发表水稻株高调控的组蛋白修饰机制

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发表单位:华南农业大学生命科学学院

发表日期:2022年7月14日

期    刊:Plant Communications(IF: 8.625)


2022年7月14日华南农业大学生命科学学院刘耀光院士团队在Plant Communications(IF: 8.625)发表题为“Rice OsUBR7 modulates plant height by regulating histone H2B monoubiquitination and cell proliferation”的研究论文。该研究发现了一个水稻蛋白UBR7行使H2BK148ub E3连接酶的功能,与E2结合酶OsUBC18协调发挥作用。OsUBR7通过介导一些染色质位点的H2Bub1,使靶基因正常表达,调控株高。OsUBR7可以作为一种尚未开发的作物改良表观遗传资源。爱基百客为其提供ChIP-seq的技术支持

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研究背景


水稻是人类重要的粮食作物之一,耕种与食用的历史都相当悠久。株高是决定植株抗倒伏能力和产量的重要农艺性状,同时也是制约水稻产量的重要因素之一。因此,水稻育种中大量的研究工作用于寻找替换矮杆基因,过去几十年鉴定得到一些调控株高和抗倒伏的基因。


表观遗传修饰,如DNA甲基化和组蛋白修饰,通过调控转录活性在真核生物的多种细胞过程和发育中发挥重要作用,因此,由蛋白质编码和非编码基因控制的表观遗传多样性可能为作物改良提供额外的变异来源。蛋白连接酶E3 成分N-Recognin7(UBR7),以及这种类型的E3连接酶使用其独特的UBR7锌指结构单泛素化H2B,通过调控细胞粘附基因抑制乳腺肿瘤的发生和转移。然而,植物UBR7同系物是否行使组蛋白修饰功能,以及它们是否调节株高和发育仍然不清楚。



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研究思路


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03

研究结果


  1. 水稻半矮秆新突变体的特征分析


作者此前基于植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统构建了一个水稻突变体库,靶向突变各种基因。分析突变体库发现水稻品种粳稻(O.sativa ssp. japonica)的Os06g0529800/LOC_Os06g33810基因的靶突变体表现出株高降低(与野生型比较)。Os06g0529800编码人UBR7的同系物,将这个基因命名为OsUBR7,它的突变体等位基因命名为osubr7。除了株高减少,突变体植株也表现出谷粒宽度、长度略微减少,叶子长度短,分蘖数增加。 


   为了确认OsUBR7突变确实造成这些表型差异,作者构建了一个遗传互补载体转入突变体系。结果发现它们的株高与突变体比较有明显的增长。另外,构建一个超表达载体转入突变体系,这些T2突变体株系也表现出明显的株高增长。总而言之,这些结果证明OsUBR7确实调控水稻株高。


   水稻株高取决于节间的数量和长度,节间长度是由中间分生组织的细胞分裂和细胞伸长决定的。比较osubr7突变体和野生型,发现它们的节间数目一样,但osubr7突变体所有的节间都更短(图1C和D)。此外,基部节间表现出更大的长度缩短(图1E)。对突变体表型的分析证实osubr7和WT之间节间和谷粒的差异主要是由于组织里不同的细胞数目造成的。


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图1 节间细胞和颖片细胞的减少导致子代植株半矮化,颗粒变小



2.OsUBR7编码一个假定的核定位UBR7 finger-E3连接酶


序列分析cDNAs显示OsUBR7的cDNA有1678bp长,包含139bp的5’UTR和276bp的3’UTR(图2A)。1260bp开放阅读框编码一个假定的UBR蛋白,命名为OsUBR7,包含一个UBR-box结构域和一个PHD finger。根据结构域作者推测OsUBR7可能充当E3连接酶,以组蛋白为底物。利用qRT-PCR分析OsUBR7的表达模式,OsUBR7在所有的器官和组织中均有表达(图2C)。


另外,作者构建了一个融合GUS报告基因的载体,转入植株。结果显示GUS信号普遍存在于转基因植物内,包括根、叶、叶鞘、小穗、雌蕊、雄蕊、颖片和茎(图2D-2J)。亚细胞定位显示OsUBR7定位于核内(图2K)。总的来说,这些结果表明OsUBR7是组成型表达,且编码一个核定位蛋白,与其在组蛋白单泛素化中的推测功能一致。


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图2 OsUBR7是组成性表达的,编码一个核定位UBR7蛋白质


3.H2B是OsUBR7的单泛素化底物


为了确定由OsUBR7修饰的候选底物,作者使用超表达OsUBR7-FLA融合蛋白的转基因植株OsUBR7OE#9做Co-IP实验。LC-MS/MS分析免疫沉淀产物鉴定到一个H2B蛋白(图3A)。基于Co-IP/MS的结果和OsUBR7包含一个组蛋白识别PHD的事实,作者通过体外pull-down实验检测了OsUBR7和4个水稻核心组蛋白(H3,H4,H2A和H2B)的互作关系。另外作者做了BiFC验证OsUBR7和组蛋白H2A或H2B的互作。基于这些结果,作者推测H2A和/或H2B可能是OsUBR7的底物。体外泛素化系统显示OsUBR7在体外单泛素化H2B而非H2A,人UbcH5b是最适合OsUBR7的E2结合酶。此外,作者也发现人UBR7特异的E2结合酶UbcH6不能与OsUBR7结合(图3D)。


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图3 H2B是OsUBR7介导的单泛素化的底物。



4.OsUBC18作为OsUBR7的特异E2结合酶在K148介导H2Bub1


水稻中有39个基因编码E2结合酶,分析这些酶与人UbcH5b的序列相似性,发现OsUBC18最有可能是UbcH5b的同源基因。OsUBC18与OsUBR7共定位于细胞核,体外pull-down、BiFC证实了它们在细胞核的互作。


随后作者利用硫代酸酯测定实验发现His-OsUBC18结合Ub。体外泛素化实验发现在His-OsUBC18的帮助下His-OsUBR7在体外单泛素化MBP-OsH2B。为了确定H2B的单泛素化位点,作者比较了水稻10个H2B变体和人H2B的氨基酸序列。人UBR7在K120位点单泛素化人H2B,根据比对结果作者选择了K136、K144和K148作为OsUBR7可能的靶赖氨酸位点。然后作者构建了这些位点的突变,进行体外泛素化实验。只有K148R的突变会导致修饰过MBP-H2bub1带完全消失,暗示H2B变体的这个赖氨酸位点对应于OsH2B.1的K148是OsUBR7的靶物。


作者利用抗泛素化组蛋白H2B特异的抗体检查了osubr7和WT植株全局的H2Bub1水平。结果显示突变体中H2Bub1水平显著低于野生型,进一步暗示OsUBR7在体内充当H2BK148ub连接酶。

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图4 OsUBR7在K148单泛素化H2B,OsUBC18作为其特异性的E2



5.OsUBR7通过介导H2Bub1调控靶基因表达和细胞增殖


此前研究显示人H2BK121ub1和相关的组蛋白H3K79甲基化影响靶基因的表达。因此,作者推测OsUBR7可能在转录激活上扮演重要作用。为了找出OsUBR介导组蛋白修饰转录激活的基因,作者在野生型和osubr7幼苗中进行ChIP-seq(使用抗-H2Bub1抗体)和转录组测序。


ChIP-seq的结果显示osubr7 vs WT的差异分析中1654个基因位点的H2Bub1水平(1695个peaks)下调,数目高于上调的H2Bub1水平(253个peaks)的基因。这些差异peaks分布在整个基因组上。选择2个多效性基因和2个细胞周期相关基因做ChIP-qPCR验证,证明这些基因位点的H2Bub1水平确实是减少的(图5B)。这些结果暗示OsUBR7确实在一些染色质位点充当H2B单泛素化的功能。


联合ChIP-seq和RNA-seq数据分析,osubr7 vs WT中作者选择了重叠的119个H2Bu1水平下调的基因和表达下调的基因,这些基因可能是OsUBR7直接调控的靶基因。其中,几个基因是负责水稻的多效性表型,比如OsGS2调控株高和叶片颜色,FLO2调控籽粒尺寸。随后作者选择了5个基因做qPCR分析,证实它们在osubr7中表达减少(图5C)。


GO分析这些H2Bub1下调的基因,结果显示功能类“正向调控有丝分裂细胞周期G2/M转变”和“有丝分裂细胞周期”是显著富集的。如预期地,19个细胞周期相关基因的表达水平在osubr7突变体中显著下降,其中包括一些细胞周期标记基因CDKB;1、CDKB2;1、CDKD;1、CYCA2;1、CYCA3;2和H4。


OsUBR7参与细胞周期相关基因的转录激活能够解释观察到osubr7突变体节间和颖片细胞数目明显减少的现象。作者另外进行流式细胞术分析osubr7和野生型幼苗的细胞周期进程。与野生型比较,osubr7幼苗突变体细胞核带有4C DNA含量的比例明显更高(图5E),在细胞周期S和G2/M期明显有更多的细胞(图5F),暗示突变体中细胞周期进程被抑制。


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图5 由OsUBR7介导的H2Bub1减少下调靶基因表达导致细胞周期进程的抑制



6.水稻驯化过程中OsUBR7的分化可能经历过选择


为了弄清楚OsUBR7的遗传多样性,基于水稻公共基因组数据作者调查了这个位点的单体型变异。分析了1491个粳米、3019个籼稻和4个野生水稻品种98材料O. rufipogonO. barthiiO. longistaminataO. minuta和O.brachyantha),共有23个SNPs在OsUBR7编码区检测到,24个单倍型(cH1-cH24)被归类。分析结果说明这些主要的单倍型变异发生在水稻亚种的驯化过程中,并且是被选择的,尤其在粳稻群体。作者进一步分析了OsUBR7位点及其附近位点群体差异(Fst)和pooled heterozygosity(Hp)。结果表明,在水稻亚种的驯化过程中,存在遗传分化的OsUBR7等位基因应该经过了自然选择和人工选择,从而导致高度的固定。


为了了解OsUBR7等位基因在粳稻和籼稻品种群体间的单倍型变异是否会影响表达活性,利用qRT-PCR分析4个粳稻和籼稻品种。结果表明,这些粳稻品种的OsUBR7表达量比籼稻品种高(图6C)。值得注意的是,在大部分籼稻材料中检测到pH2-pH4和pH6-pH13单倍型,籼稻材料均携带3个常见SNPs,这可能与籼稻品种OsUBR7等位基因的转录活性下降有关。这些发现表明,水稻亚种的遗传多样性、功能活性和器官发育之间可能存在着相关性。为了进一步分析OsUBR7不同单倍型是否会影响株高,利用来自RiceVarMap2的527份水稻材料的株高数据,对优势单倍型(cH1-cH5和pH1-pH5) 与株高进行特异性关联分析。作者发现OsUBR7单倍型cH3、cH5和pH4与株高显著相关。

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图6 水稻驯化过程中OsUBR7位点主要单倍型的分布和选择



7. OsUBR7在育种中调节株高的潜在用途


优良的半矮杆水稻品种理想株高范围在90-115cm。为了测试OsUBR7等位基因突变体能否用于改良水稻株高,作者敲除了粳稻品种Taichung 65(T65)的OsUBR7,其株高不合理(约120cm)且低分蘖数。osubr7-T65突变体株系相比于野生型表现出更好的株高(90-95cm)。虽然这些株系的粒重略有下降,但由于单株分蘖数(穗数)的增加,单株产量与WT的差异不显著,这表明OsUBR7的突变等位基因在水稻育种中的应用潜力。



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研究结论


在该研究中,作者鉴定得到一个水稻同源基因OsUBR7编码人UBR7的同系物。由于节间细胞数量减少,OsUBR7的CRISPR/Cas9敲除突变体表现出半矮杆表型。作者证明OsUBR7与E2结合酶OsUBC18特异地互作,在K148位点行使H2Bub1E3连接酶的作用。H2Bub1水平在全基因组和特定的基因组位点显著减少,多个细胞周期相关的基因显著下调,因此影响突变体中的细胞增殖。 


作者证明OsUBR7位点区域是高度多态的,不同的OsUBR7等位基因可能在进化中经历选择,并且促成了粳稻和籼稻品种的驯化。实际上,粳稻和籼稻品种的不同OsUBR7等位基因(不同单倍型)表现出不同的转录活性,它们中的一些与株高有关。这个遗传分化可能对品种的适应能力和发育可能有些影响。总的来说,该研究建立了一个新的表观调控机制,通过这个机制OsUBR7作为H2BK148ub连接酶,调控株高和其他特征。


文献链接: https://pan.baidu.com/s/18iayu1YFHSr0lkf-WmLD7Q 提取码: 1153 


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