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客户文章 | ChIP-seq助力揭示水稻油菜素内酯信号调控株高的机制

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发表单位:中国农业科学院作物研究所
发表日期:2021年7月5日
期    刊:Plant Cell(IF:12.085)



2022年7月5日,中国农科院作科所童红宁课题组在植物权威期刊Plant Cell(IF:12.085)发表题为“Rice DWARF AND LOW-TILLERING and the homeodomain protein OSH15 interact to regulate internode elongation via orchestrating brassinosteroid signaling and metabolism”的研究论文。爱基百客为该研究提供ChIP-seq的技术支持。


01

研究背景


茎的伸长对叶片和分支等其他器官的发育至关重要,秆长(或株高)是影响作物抗倒伏能力的关键农艺性状。研究兼具抗倒伏、产量高等优良性状的农作物仍然是育种的主要目的。在植物中赤霉酸(GAS)和油菜素内酯(BR)均可以影响植物株高。水稻秆由5 ~ 7个节间组成,这些节间的长度决定了植株的高度和抗风能力,对水稻的田间性能至关重要。BR是一种植物激素,可以调控植物株高,当BR合成或信号传导出现缺陷时,例如BR受体基因(BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1,OsBRI1)突变通常会导致第二节间(IN2)长度明显短于第一节间(IN1),造成水稻矮小,这种表现也被称之为d6-型侏儒症。作者采用BR信号轻微缺陷型突变体(dwarf and low-tillering,dtl)进行相关研究,以此揭示BR对不同节间影响。


02

研究材料


水稻:dlt、s76、s140、d76、d140突变体和ZH11野生型

03

研究思路



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研究结果



1

鉴定dlt增强子-d6型侏儒症


作者利用叠氮化钠作为诱变剂对dlt种子进行诱变,通过筛选发现了一些dlt增强子,它们进一步降低了株高。为了确定参与节间伸长控制的其他基因,作者筛选了两种dlt增强子d76和d14突变体进行后续分析。d76和d140表现出典型的d6型侏儒症模式。作者将突变体与野生型中华11(ZH11)水稻杂交进行遗传分析,在F2代中,29株表现为d6型侏儒症,其他植株表现为dlt或野生型表型,表明d6型矮小性状是受隐性突变控制。将这些子代与野生型进行回交后得到了单突变体s76和s140,与各自双突变体相比而言,单突变体株高有所增加,但是仍旧表现出与双突变体类似的d6型侏儒症。


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图1两种d6型侏儒症水稻

2

s76和s140是d6/osh15的新等位基因,用来定义d6型侏儒症创始突变体



将s76和s140分别与ZH11进行回交,在F2子代分别收集了18和76个突变体进行高覆盖率的全基因组测序,找到单核苷酸多聚(snp)指数接近1的突变。在两个突变体库中,7号染色体相似位置的目标突变区域发现了典型的关联峰,并确定OSH15基因是两个突变体的候选基因。s76突变体在氨基酸W276处携带一个G-A突变,产生了提前终止密码子,而s140包含一个C-T突变,导致p286s替换。考虑到s76和s140突变体与d6/osh15的表型高度相似,认为s76和s140是d6型侏儒症的新等位基因。



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图2利用突变图谱策略克隆突变体基因


3

在不同节间OSH15和DLT表达



通过RT-qPCR技术发现OSH15在幼苗组织中的表达量相对较低,但在穗间和节间中表达量较高,有趣的是在IN2表达量明显高于第一节间。随后通过GUS染色进一步证实了上述结论,并发现在IN2OSH15启动子活跃度非常强,染色深度从IN1到IN3逐渐增强。横切面显示,OSH15在除了在IN2的分裂区外,大多数薄壁细胞中均有特异性表达。相比于OSH15来说,DLT总体上显示轻度活跃,GUS染色程度从IN1到IN3逐渐减弱,在薄壁细胞中显示出特异性。OSH15和DLT基因表达存在重叠区域,但是在不同节间呈现相反特异性。OSH15蛋白定位在细胞核和细胞质中并且与DLT存在共定位。酵母双杂交、裂解荧光素酶互补及免疫共沉淀(Co-IP)实验结果均证明DLT与OSH15蛋白存在互作。


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图3 DLT与OSH15之间的表达特异性及相互


4

OSH15参与了BR响应


与野生型相比较,s76和s140,以及d76和d140突变体对于BR处理敏感性较低。OSH15参与了BR反应,并可能与DLT相互作用,调节BR信号传导和生物合成。



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图4 OSH15调控了BR响应


5

dlt和osh15表现出组织依赖的遗传关系


在幼苗时期,s76和s140突变体株高未见明显缩短,但是dlt、d140及d76双突变体株高明显缩短。DLT与OSH15协同调控了幼苗高度,在控制分蘖数方面具有拮抗作用。DLT部分依赖OSH15调控茎秆长度。与DLT相比,OSH15在调控IN2时具有上位性,在调控IN1时具有附加效应。DLT和OSH15对节间细胞的横向生长具有拮抗作用。有趣的是,s76和s140的米粒宽度明显增加,而且d76和d140的粒宽增加程度更为明显,说明DLT和OSH15在调节粒宽方面具有协同效应。这些发现表明DLT和OSH15之间存在组织依赖的遗传关系。



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图5 DLT和OSH15在不同的组织中表现出不同的遗传关系


6

DLT与OSH15协同激活幼苗相关基因表达


通过转录组分析,作者在dlt突变体中发现1128个下调和217个上调基因,在s140突变体中发现866个下调和348个上调基因,在d140中发现1853个下调和213个上调基因。s140和dlt突变体中存在729个具有相同表达模式基因;s140、dlt与d140突变体分别存在1050、801个相同表达模式基因。这些基因在d140突变体中表达量明显低于单突变体。此外,在dlt、s140及d140突变体中存在1197个下调基因。相反,656个基因仅在双突变体中下调,而在任何单一突变体中都没有下调。由于DLT和OSH15同时丧失功能,这些额外基因的表达被抑制。这些结果表明,DLT和OSH15相互合作,其中DLT在激活幼苗基因表达过程中发挥了更多主导作用。

作者通过用IN1和IN2作为材料进行转录组分析。作者发现在IN1中,dlt突变体中有5755个下调,4926个上调基因;在s140突变体中,存在1981个下调,1816个上调基因,d140中有463个下调,4354个上调基因。在IN2中,作者发现dlt中有2801个下调,2532个上调基因,s140突变体中3377个下调,2252个上调基因,d140中6598个下调,4170个上调基因。幼苗和节间之间缺乏共同调控的差异基因,可能是由于两种组织中独特的转录组谱,亦或者OSH15和DLT在两种组织中对基因表达谱的调控存在差异所导致。


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图6 DLT和OSH15共同调节组织中的基因表达


7

OSH15激活OsBRI1的表达,DLT促进调控


为了进一步探索OSH15是否直接靶向BR相关基因,作者利用染色质免疫共沉淀测序(chip-seq)来寻找OSH15结合区域,结果显示有12个BR相关基因被关联到,主要包括BR信号基因,说明OSH15可能直接调控BR稳态和信号传导。OsBRI1基因启动子区域存在4个OSH15结合位点,OSH15与其中三个密切相关,并与其中两个位点存在互作。OSH15会激活OsBR11表达,与DLT存在协同效应。


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图7 OSH15靶向并促进OsBRI1的表达


8

在突变体中,幼苗和穗中Br水平上调,节间Br水平下调


作者还分析了几个BR生物合成基因在穗状花序、IN1和IN2中的表达。这些基因通常在圆锥花序中表达增加,但在节间表达减少,这表明BR水平可能在不同组织中受到相反调节。由于BR代谢和BR信号两者之间的调控极为复杂,很难根据表达分析确定植物中BR水平最终如何受到影响。因此,作者直接量化了突变体和野生型植物中各种组织中的溴含量,包括幼苗、圆锥花序、IN1和IN2。蓖麻甾酮(CS)是一种主要具有活性的BRs,在幼苗期中,与野生型相比,dlt和s140中CS水平均显著增加,d140中CS水平增加程度明显高于单突变体。虽然在幼苗期OSH15单独对CS水平影响较小,但是其通过与DLT互作却可以对CS水平起到显著影响。这一结论在d76突变体中也得到进一步证实,表明DLT和OSH15以协同方式调节BR反应。相反,在IN1和IN2中,大多数突变体中CS含量明显降低,这一发现表明在不同组织中DLT和OSH15在调节BR中发挥着不同的作用。在IN1中,与单个突变体相比,d140突变体中CS水平降低程度更加明显。然而,在IN2中,d140突变体中CS水平与s140突变体中相似,表明在调节BR生物合成过程中,OSH15与DLT相比具有上位性。

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图8 DLT-OSH15复合物以一种组织特异性的方式调节BR的含量

05

结论

   

     在本研究中,作者采用BR信号轻微缺陷型突变体(dwarf and low-tillering,dtl)进行相关研究。发现了两种具有下节间特异缩短的突变体,即d6型侏儒症。这两种突变体拥有同样的致病基因,即OSH15基因,此基因可以编码含有同源结构域蛋白质。OSH15可直接与DLT相互作用,形成蛋白复合物,调节BR含量和BR信号转导。例如OSH15和DLT可以同时直接结合在OsBRI1基因启动子上促进基因表达。OSH15基因在短节间中大量表达,尤其是在IN2,而DLT却显示出相反表达模式。因此这个复合物在不同节间显示出不同水平,对BR水平和信号产生不同效应来影响节间组织。


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