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武汉爱基百客生物科技有限公司（简称爱基百客），位于武汉高农生物园，办公面积逾3000m2，是一家专业提供单细胞与空间组学测序分析、表观组学科研服务和高通量测序分析的新型生物科技服务企业。

公司旨在为客户提供最专业的科研服务，运营至今合作的科研客户近千家，涵盖国内知名科研院所、高校以及相关生物企业，运营至今销售额超1亿元，科研成果曾多次在Cancer Cell、Plant Cell、Nature Communications、J HEMATOL ONCOL等国际高水平学术期刊发表，受到了客户广泛好评，是国内成长最迅速的高通量测序科研服务企业之一。

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一文了解DNA甲基化测序方法和研究思路

介绍

甲基化修饰是表观遗传学调控的一种重要形式，与癌症、衰老、植物生长发育等密切相关，常见的有DNA甲基化修饰和RNA甲基化修饰。其中，DNA甲基化是指在DNA的序列不变的条件下，在其中某些碱基上加上甲基的过程。常见的DNA甲基化修饰有5mC、5hmC和6mA。DNA甲基化的结果一般是使甲基化位点的下游基因表达量变少。

DNA甲基化测序方法

目前使用的DNA甲基化检测方法主要有两大类。第一类是基于重亚硫酸盐处理的测序方法，主要包括（1）全基因组甲基化测序WGBS；（2）简化甲基化测序RRBS；（3）精准DNA甲基化/羟甲基化测序oxBS-seq。

第二类是基于特异性抗体捕获的测序方法，主要包括（4）甲基化DNA免疫共沉淀测序meDIP-seq；（5）羟甲基化DNA免疫共沉淀测序hmeDIP-seq；（6）6mA免疫共沉淀测序6mA-IP-seq。

这么多研究方法到底该如何选择？想知道的话就继续往下看吧！

WGBS

技术原理

基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法，首先通过重亚硫酸盐对样本DNA进行处理，将未甲基化的C碱基转化为U碱基，而甲基化的C碱基则不会改变，进行PCR扩增后U碱基会变成T，与原本甲基化的C碱基区分开，再结合高通量测序技术，可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。

技术路线

技术优势

1.覆盖全基因组范围内的所有位点

2.单碱基分辨率

3.DNA甲基化研究的“金标准”

4.适用于基因组较小的样本

案例分享

Genome-wide DNA methylation reveals potential epigenetic mechanism of age-dependent viral susceptibility in grass carp

全基因组DNA甲基化揭示了草鱼年龄相关性病毒易感性的潜在表观遗传机制（Immunity & Ageing；IF2022=9.701 ）

背景

草鱼对呼肠孤病毒（GCRV）表现出年龄依赖性，在此项研究中，作者调查了5月龄 (FMO) 草鱼和3岁龄(TYO)草鱼之间的全基因组DNA甲基化和基因表达变异，以揭示年龄依赖性病毒的潜在表观遗传机制。

方法

利用WGBS技术检测FMO和TYO两组草鱼的DNA甲基化修饰。探讨甲基化修饰对草鱼年龄依赖性GCRV易感性的影响。

研究结果

WGBS检测到FMO和TYO两组草鱼的全基因组范围内分别约有4.99%和4.80%的胞嘧啶被甲基化。其中，在CG序列环境中，FMO和TYO的胞嘧啶甲基化率分别为51.42%，和49.40%，而CHG和CHH序列环境中（H为A，C或T），胞嘧啶的甲基化率分别不超过0.10%和0.09%。

在已鉴定出的mC位点中，98%以上来自CG序列环境，而分别不超过0.4%和1.5%位于CHG和CHH序列环境（图1C）。此外，还分析了CG（mCG），CHG（mCHG）和CHH（mCHH）位点附近的基因组序列偏好性，结果显示mCG侧翼区域或mCHG和mCHH上游区域没有序列偏好；然而，mCHG和mCHH背景的碱基几乎总是腺嘌呤，其次是胸腺嘧啶，而胞嘧啶的观察频率较低。80%以上的mC位点显示高甲基化水平 (ML≥70%)。

两组草鱼呼肠孤病毒（GCRV）的年龄依赖性易感性和全基因组甲基化特征

RRBS

技术原理

利用限制性内切酶Msp I酶对基因组进行酶切，富集CpG片段，再进行Bisulfite测序，从而对富集片段的甲基化展开分析的技术。

技术路线

技术优势

1.单碱基分辨率

2.覆盖位点为CpG岛和promoter区域

3.高效、经济，性价比高

4.应用前景广泛，适合基因组较大或数量较多的样本

案例分享

Aberrant overexpression of HOTAIR inhibits abdominal adipogenesis through remodelling of genome-wide DNA methylation and transcription

HOTAIR异常过表达通过重塑全基因组DNA甲基化和转录抑制腹部脂肪形成（Molecular Metabolism；IF2022=8.568）

背景

HOTAIR相关的表观遗传修饰可能具有细胞特异性。目前尚不清楚HOTAIR是否可以调节DNA甲基化，特别是在前脂肪细胞或分化的脂肪细胞中。在本文章中，作者研究了Abd HOTAIR-OE组和Abd对照组细胞中分化第0天和第14天的全基因组DNA甲基化状态，以揭示脂肪分化过程中HOTAIR介导的DNA甲基化表观遗传调控机制。

方法

利用RRBS检测Abd HOTAIR-OE组和Abd对照组细胞中分化第0天和第14天的全基因组DNA甲基化状态。

研究结果

主成分分析和双因素方差分析结果显示，全基因组CG甲基化水平高低主要与HOTAIR是否过表达有关，时间因素影响次之。HOTAIR过表达显著增加了CG甲基化水平，特别是在第0天；脂肪发生过程增加了Abd对照细胞中的CG甲基化，但对Abd HOTAIR-OE细胞没有影响。作者发现在第0天观察到更多的HOTAIR高DMG，但在脂肪分化（第14天）之后，观察到更多的低DMG。此外，作者检测了HOTAIR过表达介导的DMG在分化第0天和第14天之间的状态，发现大多数（超过84%）的基因体和启动子DMG（高和低）可以维持其甲基化状态，这表明这些基因的甲基化是恒定的并且持续受到HOTAIR的影响。

应用RRBS分析HOTAIR过表达对腹部脂肪形成过程中全基因组甲基化的影响

oxBS-seq

技术原理

利用高钌酸钾将5hmC氧化为甲酰基修饰（5fC），5fC可以被重亚硫酸盐转换为碱基T，从而排除了5hmC的干扰，实现全基因组DNA甲基化的精准检测。

技术路线

技术优势

单碱基分辨率
可区分5mC和5hmC
应用广泛，包括oxWGBS和oxRRBS等
精准甲基化和羟甲基化检测的“金标准”

案例分享

Transcriptomic and epigenomic analyses uncovered Lrrc15 as a contributing factor to cartilage damage in osteoarthritis

转录组学和表观组学分析发现Lrrc15是骨关节炎软骨损伤的促进因素

（Scientific Reports；IF2022=4.525）

背景

研究发现人类骨关节炎OA软骨中存在DNA甲基化变化，体内外研究强调了DNA甲基化对软骨内稳态和OA的重要性，此外，建立了OA和表观遗传改变之间的联系。在本研究中，作者进一步分析OA过程中5mC和5hmC的变化，以揭示表观遗传变化对OA的作用。

方法

利用RNA-seq和RRoxBS分析DMM术后4周和12周的小鼠软骨组织中的基因表达量和DNA甲基化模式。

研究结果

DMM术后4周发现了842个差异甲基化的5mc和318个差异甲基化的5hmc，DMM术后12周时差异甲基化的胞嘧啶数量显著增加。在DMM术后4周发现了与89个与90个特殊基因相关的DMRs，在DMM术后12周发现了756个与489个特殊基因相关的DMRs。通过GO分类对术后4周和术后12周的DEGs和DMRs进行功能整合，发现有58个重叠的生物过程和6个重叠的分子功能。转录组和表观遗传分析证实了人类样本和小鼠组织中基因和DNA甲基化的变化，进一步证实了OA过程中伴随着关节软骨转录组和DNA甲基化的时间依赖性变化。

RRoxBS分析证实了手术诱导OA后小鼠分离软骨中5mC和5hmC的变化

meDIP-seq

技术原理

基于抗体富集原理进行测序的全基因组甲基化检测技术，采用甲基化DNA免疫共沉淀技术，通过5mC抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段，然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。

技术路线

技术优势

1.精确度高：基因组位点定位精确性可达±50bp

2.检测范围广：全基因组范围内甲基化区域研究

3.适合大量样本的甲基化研究

案例分享

Integrative analysis of DNA methylation and gene expression reveals key molecular signatures in acute myocardial infarction

DNA甲基化和基因表达的综合分析揭示了急性心肌梗死的关键分子特征

（Clinical Epigenetics；IF2022=7.259）

背景

急性心肌梗死（AMI）由于其发作迅速和高致死率，一直是所有类型心脏病中最致命的疾病之一。准确了解多组学分子特征在AMI早期阶段的变化对于其治疗至关重要。表观遗传特别是DNA甲基化，是了解疾病分子机制的有希望的方法。在本研究中，作者鉴定了DNA甲基化变异及其对AMI基因表达的影响，以DNA甲基化的角度提供潜在的诊断标志物和治疗靶点。

方法

利用RNA-seq和MeDIP-seq分析6种不同AMI小鼠模型（Sham，AMI=10min、1h、6h、24h、72h）的心脏组织中基因表达量变化和全基因组DNA甲基化水平。

研究结果

为了探索DNA甲基化修饰与AMI之间的关系，作者分析了peak、关联基因和基因功能元件。结果显示基因组上peak分布在不同的时间点没有太大变化，但微小的差异导致了基因转录水平的巨大变化。在AMI 10min、1h、6h、24h、72h时分别获得了18814，18614，23587，26018和33788个差异甲基化位点（DMP）。DMP的低甲基化位点分别为7951（42%）、9108（49%）、1212（51%）、12707（49%）、13631（52%），从DMP的时间分布中发现，随着AMI的逐步发展，DMP的数量和区别越来越大。大量研究表明，启动子区域的DNA甲基化会影响基因表达，因此作者选择启动子区域中的CpG岛进行进一步分析，并在AMI后设定的时间点分别鉴定了2638，2477，2979，3704和5881个DMP。

AMI小鼠模型在一系列时间点的全基因组DNA甲基化分析

hmeDIP-seqS

技术原理

利用5hmC抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段，在高CpG密度、高DNA甲基化水平区域具有很好的抗体亲合性，然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。

技术路线

技术优势

特异性检测羟甲基化：5hmC抗体能够区分5mC和5hmC信号
精确度高：基因组位点定位精确性可达±50bp
检测范围广：全基因组范围内甲基化区域研究
适合大量样本的甲基化研究

案例分享

The hMeDIP-Seq identified INPP4A as a novel biomarker for eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps

hMeDIP-Seq鉴定出INPP4A为嗜酸性慢性鼻窦炎伴鼻息肉的新型标志物（Epigenomics；IF2022=4.357）

背景

嗜酸性慢性鼻窦炎伴鼻息肉（ECRSwNP）是慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）的一种内型，其症状更严重，与哮喘的相关性更强，复发风险更大。目前尚不清楚DNA羟甲基化是否会影响ECRSwNP。

方法

利用hmeDIP-seq检测三组参与测试人员（ECRSwNP、非ECRSwNP及健康组）的DNA羟甲基化水平。

研究结果

绘制了5hmC分布的基因组甲基化图谱。在ECRSwNP和NECRSwNP之间共鉴定出36个差异羟甲基化区域（DhMRs），包括ECRSwNP中的10个高羟甲基化区域和26个低羟甲基化区域。随后检测了DhMRs在整个基因中的分布。基于ECRSwNP和NECRSwNP对DhMRs的注释和修饰，共鉴定出26个DhMR。3个基因（CCL7、SEL1L2和OXCT1-AS1）的启动子区存在差异羟甲基化，而其余23个基因的基因本体区存在差异羟甲基化。与对照相比，在ECRSwNP中检测到273个DhMRs和169个DhMG，其中23个基因在启动子区域表现出差异峰，在NECRSwNP和对照之间仅检测到一个DhMG，即DACH2。

嗜酸性与非嗜酸性慢性鼻窦炎伴鼻息肉的DNA羟甲基化比较

6mA-IP-seq

技术原理

利用DNA 6mA修饰特异的抗体对基因组上发生6mA修饰的区域进行富集，结合高通量测序，对基因组上的6mA修饰进行定位。

建库测序流程

技术路线

技术优势

1.精确度高：基因组位点定位精确性可达±50bp

2.检测范围广：在全基因组范围进行检测

3.针对性强：针对基因组上有6mA修饰的区域进行检测，降低测序量减少成本

4.适用范围广：适用于大部分物种

案例分享

BcMettl4-mediated DNA adenine N 6-methylation (6mA) is critical for virulence of Botrytis cinerea BcMettl4

介导的DNA腺嘌呤N6甲基化对灰霉病菌的毒力至关重要

（Frontiers in Microbiology；IF2022=6.064）

背景

6mA在各种生物学功能中起关键作用，但其在丝状病原体中的功能尚未探索。灰霉菌是一种重要的致病菌。本研究对灰霉菌中6mA进行了系统分析，发现6mA广泛分布于灰霉菌的基因组中。

方法

收集孢子萌发24 h的突变体ΔBcMettl4及其野生型菌株B05.10样本进行6mA-IP-seq，每株ΔBcMettl4和B05.10进行3个生物重复。检测它们的6mA甲基化。

研究结果

3个B05.10生物学重复中共捕获30320个6mA富集区域，而从3个ΔBcMettl4生物学重复中共捕获28385个6mA富集区域。这些结果进一步证实了BcMETTL4被破坏后可以降低灰霉菌的甲基化水平。对获得的序列进行组装后发现，57% 6mA peak分布在基因的上游区域，其次是外显子，15%分布在野生型和突变型的下游区域。对6mA peak进行了进一步研究，B05.10显示出1297个独特的6mA peak，而ΔBcMettl4中发现了689个独特的6mA peak。在B05.10和ΔBcMettl4中有8357个共有的6mA peak。B05.10的独特6mA peak中关联到2396个基因，而ΔBcMettl4的独特6mA peak中仅关联到1330个基因。