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武汉爱基百客生物科技有限公司(简称爱基百客),注册于2014年12月31日,次年10月正式开始对外运营,是一家专业提供表观组学技术服务、高通量测序、单细胞测序分析的新型生物科技服务企业。

公司总员工已达到百余人,其中95%以上具有学士学位,40%以上具有硕士及以上学位,专职科研人员20余人,专职销售人员30余人,覆盖全国90%的省市,核心成员来自国内知名高效、基因测序公司、信息分析公司等。

公司运营至今销售额累积1亿左右,成为国内成长最迅速的二代测序与生物科研服务企业之一。




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新闻资讯

详细内容

一文了解DNA甲基化测序方法和研究思路

01

介绍



甲基化修饰是表观遗传学调控的一种重要形式,与癌症、衰老、植物生长发育等密切相关,常见的有DNA甲基化修饰和RNA甲基化修饰。其中,DNA甲基化是指在DNA的序列不变的条件下,在其中某些碱基上加上甲基的过程。常见的DNA甲基化修饰有5mC、5hmC和6mA。DNA甲基化的结果一般是使甲基化位点的下游基因表达量变少。


02

DNA甲基化测序方法


目前使用的DNA甲基化检测方法主要有两大类。第一类是基于重亚硫酸盐处理的测序方法,主要包括(1)全基因组甲基化测序WGBS;(2)简化甲基化测序RRBS;(3)精准DNA甲基化/羟甲基化测序oxBS-seq。
第二类是基于特异性抗体捕获的测序方法,主要包括(4)甲基化DNA免疫共沉淀测序meDIP-seq;(5)羟甲基化DNA免疫共沉淀测序hmeDIP-seq;(6)6mA免疫共沉淀测序6mA-IP-seq。
这么多研究方法到底该如何选择?想知道的话就继续往下看吧!

1

     WGBS

技术原理


基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法,首先通过重亚硫酸盐对样本DNA进行处理,将未甲基化的C碱基转化为U碱基,而甲基化的C碱基则不会改变,进行PCR扩增后U碱基会变成T,与原本甲基化的C碱基区分开,再结合高通量测序技术,可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。

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技术路线


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技术优势



1.覆盖全基因组范围内的所有位点
2.单碱基分辨率
3.DNA甲基化研究的“金标准”
4.适用于基因组较小的样本


案例分享


Genome-wide DNA methylation reveals potential epigenetic mechanism of age-dependent viral susceptibility in grass carp 

全基因组DNA甲基化揭示了草鱼年龄相关性病毒易感性的潜在表观遗传机制(Immunity & Ageing;IF2022=9.701 )

背景


草鱼对呼肠孤病毒(GCRV)表现出年龄依赖性,在此项研究中,作者调查了5月龄 (FMO) 草鱼和3岁龄(TYO)草鱼之间的全基因组DNA甲基化和基因表达变异,以揭示年龄依赖性病毒的潜在表观遗传机制。

方法


利用WGBS技术检测FMO和TYO两组草鱼的DNA甲基化修饰。探讨甲基化修饰对草鱼年龄依赖性GCRV易感性的影响。

研究结果


WGBS检测到FMO和TYO两组草鱼的全基因组范围内分别约有4.99%和4.80%的胞嘧啶被甲基化。其中,在CG序列环境中,FMO和TYO的胞嘧啶甲基化率分别为51.42%,和49.40%,而CHG和CHH序列环境中(H为A,C或T),胞嘧啶的甲基化率分别不超过0.10%和0.09%。
在已鉴定出的mC位点中,98%以上来自CG序列环境,而分别不超过0.4%和1.5%位于CHG和CHH序列环境(图1C)。此外,还分析了CG(mCG),CHG(mCHG)和CHH(mCHH)位点附近的基因组序列偏好性,结果显示mCG侧翼区域或mCHG和mCHH上游区域没有序列偏好;然而,mCHG和mCHH背景的碱基几乎总是腺嘌呤,其次是胸腺嘧啶,而胞嘧啶的观察频率较低。80%以上的mC位点显示高甲基化水平 (ML≥70%)。

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两组草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的年龄依赖性易感性和全基因组甲基化特征


2

      RRBS

技术原理


利用限制性内切酶Msp I酶对基因组进行酶切,富集CpG片段,再进行Bisulfite测序,从而对富集片段的甲基化展开分析的技术。

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技术路线

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技术优势



1.单碱基分辨率
2.覆盖位点为CpG岛和promoter区域
3.高效、经济,性价比高
4.应用前景广泛,适合基因组较大或数量较多的样本

案例分享


Aberrant overexpression of HOTAIR inhibits abdominal adipogenesis through remodelling of genome-wide DNA methylation and transcription

 HOTAIR异常过表达通过重塑全基因组DNA甲基化和转录抑制腹部脂肪形成(Molecular Metabolism;IF2022=8.568)

背景


HOTAIR相关的表观遗传修饰可能具有细胞特异性。目前尚不清楚HOTAIR是否可以调节DNA甲基化,特别是在前脂肪细胞或分化的脂肪细胞中。在本文章中,作者研究了Abd HOTAIR-OE组和Abd对照组细胞中分化第0天和第14天的全基因组DNA甲基化状态,以揭示脂肪分化过程中HOTAIR介导的DNA甲基化表观遗传调控机制。

方法


利用RRBS检测Abd HOTAIR-OE组和Abd对照组细胞中分化第0天和第14天的全基因组DNA甲基化状态。

研究结果


主成分分析和双因素方差分析结果显示,全基因组CG甲基化水平高低主要与HOTAIR是否过表达有关,时间因素影响次之。HOTAIR过表达显著增加了CG甲基化水平,特别是在第0天;脂肪发生过程增加了Abd对照细胞中的CG甲基化,但对Abd HOTAIR-OE细胞没有影响。作者发现在第0天观察到更多的HOTAIR高DMG,但在脂肪分化(第14天)之后,观察到更多的低DMG。此外,作者检测了HOTAIR过表达介导的DMG在分化第0天和第14天之间的状态,发现大多数(超过84%)的基因体和启动子DMG(高和低)可以维持其甲基化状态,这表明这些基因的甲基化是恒定的并且持续受到HOTAIR的影响。



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应用RRBS分析HOTAIR过表达对腹部脂肪形成过程中全基因组甲基化的影响



3

    oxBS-seq

技术原理


利用高钌酸钾将5hmC氧化为甲酰基修饰(5fC),5fC可以被重亚硫酸盐转换为碱基T,从而排除了5hmC的干扰,实现全基因组DNA甲基化的精准检测。


技术路线


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技术优势



  1. 单碱基分辨率
  2. 可区分5mC和5hmC
  3. 应用广泛,包括oxWGBS和oxRRBS等
  4. 精准甲基化和羟甲基化检测的“金标准”

案例分享


Transcriptomic and epigenomic analyses uncovered Lrrc15 as a contributing factor to cartilage damage in osteoarthritis 

转录组学和表观组学分析发现Lrrc15是骨关节炎软骨损伤的促进因素
(Scientific Reports;IF2022=4.525)

背景


研究发现人类骨关节炎OA软骨中存在DNA甲基化变化,体内外研究强调了DNA甲基化对软骨内稳态和OA的重要性,此外,建立了OA和表观遗传改变之间的联系。在本研究中,作者进一步分析OA过程中5mC和5hmC的变化,以揭示表观遗传变化对OA的作用。

方法


利用RNA-seq和RRoxBS分析DMM术后4周和12周的小鼠软骨组织中的基因表达量和DNA甲基化模式。

研究结果


DMM术后4周发现了842个差异甲基化的5mc和318个差异甲基化的5hmc,DMM术后12周时差异甲基化的胞嘧啶数量显著增加。在DMM术后4周发现了与89个与90个特殊基因相关的DMRs,在DMM术后12周发现了756个与489个特殊基因相关的DMRs。通过GO分类对术后4周和术后12周的DEGs和DMRs进行功能整合,发现有58个重叠的生物过程和6个重叠的分子功能。转录组和表观遗传分析证实了人类样本和小鼠组织中基因和DNA甲基化的变化,进一步证实了OA过程中伴随着关节软骨转录组和DNA甲基化的时间依赖性变化。


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RRoxBS分析证实了手术诱导OA后小鼠分离软骨中5mC和5hmC的变化


4

   meDIP-seq

技术原理


基于抗体富集原理进行测序的全基因组甲基化检测技术,采用甲基化DNA免疫共沉淀技术,通过5mC抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段,然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。

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技术路线


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技术优势



1.精确度高:基因组位点定位精确性可达±50bp
2.检测范围广:全基因组范围内甲基化区域研究
3.适合大量样本的甲基化研究

案例分享


Integrative analysis of DNA methylation and gene expression reveals key molecular signatures in acute myocardial infarction  

DNA甲基化和基因表达的综合分析揭示了急性心肌梗死的关键分子特征
Clinical Epigenetics;IF2022=7.259)

背景


急性心肌梗死(AMI)由于其发作迅速和高致死率,一直是所有类型心脏病中最致命的疾病之一。准确了解多组学分子特征在AMI早期阶段的变化对于其治疗至关重要。表观遗传特别是DNA甲基化,是了解疾病分子机制的有希望的方法。在本研究中,作者鉴定了DNA甲基化变异及其对AMI基因表达的影响,以DNA甲基化的角度提供潜在的诊断标志物和治疗靶点。

方法


利用RNA-seq和MeDIP-seq分析6种不同AMI小鼠模型(Sham,AMI=10min、1h、6h、24h、72h)的心脏组织中基因表达量变化和全基因组DNA甲基化水平。

研究结果


为了探索DNA甲基化修饰与AMI之间的关系,作者分析了peak、关联基因和基因功能元件。结果显示基因组上peak分布在不同的时间点没有太大变化,但微小的差异导致了基因转录水平的巨大变化。在AMI 10min、1h、6h、24h、72h时分别获得了18814,18614,23587,26018和33788个差异甲基化位点(DMP)。DMP的低甲基化位点分别为7951(42%)、9108(49%)、1212(51%)、12707(49%)、13631(52%),从DMP的时间分布中发现,随着AMI的逐步发展,DMP的数量和区别越来越大。大量研究表明,启动子区域的DNA甲基化会影响基因表达,因此作者选择启动子区域中的CpG岛进行进一步分析,并在AMI后设定的时间点分别鉴定了2638,2477,2979,3704和5881个DMP。
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AMI小鼠模型在一系列时间点的全基因组DNA甲基化分析


5

hmeDIP-seqS

技术原理


利用5hmC抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段,在高CpG密度、高DNA甲基化水平区域具有很好的抗体亲合性,然后通过高通量测序可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。
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技术路线


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技术优势


  1. 特异性检测羟甲基化:5hmC抗体能够区分5mC和5hmC信号
  2. 精确度高:基因组位点定位精确性可达±50bp
  3. 检测范围广:全基因组范围内甲基化区域研究
  4. 适合大量样本的甲基化研究

案例分享


The hMeDIP-Seq identified INPP4A as a novel biomarker for eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps  

hMeDIP-Seq鉴定出INPP4A为嗜酸性慢性鼻窦炎伴鼻息肉的新型标志物(Epigenomics;IF2022=4.357)

背景


嗜酸性慢性鼻窦炎伴鼻息肉(ECRSwNP)是慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)的一种内型,其症状更严重,与哮喘的相关性更强,复发风险更大。目前尚不清楚DNA羟甲基化是否会影响ECRSwNP。

方法


利用hmeDIP-seq检测三组参与测试人员(ECRSwNP、非ECRSwNP及健康组)的DNA羟甲基化水平。

研究结果


绘制了5hmC分布的基因组甲基化图谱。在ECRSwNP和NECRSwNP之间共鉴定出36个差异羟甲基化区域(DhMRs),包括ECRSwNP中的10个高羟甲基化区域和26个低羟甲基化区域。随后检测了DhMRs在整个基因中的分布。基于ECRSwNP和NECRSwNP对DhMRs的注释和修饰,共鉴定出26个DhMR。3个基因(CCL7、SEL1L2和OXCT1-AS1)的启动子区存在差异羟甲基化,而其余23个基因的基因本体区存在差异羟甲基化。与对照相比,在ECRSwNP中检测到273个DhMRs和169个DhMG,其中23个基因在启动子区域表现出差异峰,在NECRSwNP和对照之间仅检测到一个DhMG,即DACH2。


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嗜酸性与非嗜酸性慢性鼻窦炎伴鼻息肉的DNA羟甲基化比较

6

6mA-IP-seq

技术原理


利用DNA 6mA修饰特异的抗体对基因组上发生6mA修饰的区域进行富集,结合高通量测序,对基因组上的6mA修饰进行定位。


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建库测序流程

技术路线


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技术优势


1.精确度高:基因组位点定位精确性可达±50bp
2.检测范围广:在全基因组范围进行检测
3.针对性强:针对基因组上有6mA修饰的区域进行检测,降低测序量减少成本
4.适用范围广:适用于大部分物种

案例分享


BcMettl4-mediated DNA adenine N 6-methylation (6mA) is critical for virulence of Botrytis cinerea BcMettl4 
介导的DNA腺嘌呤N6甲基化对灰霉病菌的毒力至关重要
Frontiers in Microbiology;IF2022=6.064)

背景


6mA在各种生物学功能中起关键作用,但其在丝状病原体中的功能尚未探索。灰霉菌是一种重要的致病菌。本研究对灰霉菌中6mA进行了系统分析,发现6mA广泛分布于灰霉菌的基因组中。

方法


收集孢子萌发24 h的突变体ΔBcMettl4及其野生型菌株B05.10样本进行6mA-IP-seq,每株ΔBcMettl4和B05.10进行3个生物重复。检测它们的6mA甲基化。

研究结果


3个B05.10生物学重复中共捕获30320个6mA富集区域,而从3个ΔBcMettl4生物学重复中共捕获28385个6mA富集区域。这些结果进一步证实了BcMETTL4被破坏后可以降低灰霉菌的甲基化水平。对获得的序列进行组装后发现,57% 6mA peak分布在基因的上游区域,其次是外显子,15%分布在野生型和突变型的下游区域。对6mA peak进行了进一步研究,B05.10显示出1297个独特的6mA peak,而ΔBcMettl4中发现了689个独特的6mA peak。在B05.10和ΔBcMettl4中有8357个共有的6mA peak。B05.10的独特6mA peak中关联到2396个基因,而ΔBcMettl4的独特6mA peak中仅关联到1330个基因。

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灰霉菌中6mA甲基化基因

经过上面的简单学习,您是否已经对DNA甲基化检测方法有了初步了解?如果想要深入了解的话,欢迎咨询我们!做表观认准爱基百客!

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