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武汉爱基百客生物科技有限公司(简称爱基百客),注册于2014年12月31日,次年10月正式开始对外运营,是一家专业提供表观组学技术服务、高通量测序、单细胞测序分析的新型生物科技服务企业。

公司总员工已达到百余人,其中95%以上具有学士学位,40%以上具有硕士及以上学位,专职科研人员20余人,专职销售人员30余人,覆盖全国90%的省市,核心成员来自国内知名高效、基因测序公司、信息分析公司等。

公司运营至今销售额累积1亿左右,成为国内成长最迅速的二代测序与生物科研服务企业之一。




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客户文章 | hMeDIP-Seq助力慢性嗜酸性鼻窦炎伴鼻息肉的生物标记物鉴定


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  发表单位:武汉大学人民医院

  发表日期:2022629

  期    刊:EpigenomicsIF:4.357

  研究材料:鼻息肉

    

    2022年6月29日,武汉大学人民医院耳鼻咽喉头颈外科在期刊Epigenomics(IF:4.357)发表题为“The hMeDIP-Seq identified INPP4A as a novel biomarker for eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps”的研究论文。该研究利用hMeDIP-Seq(羟甲基化DNA免疫沉淀测序)技术分析了嗜酸性慢性鼻窦炎伴鼻息肉、非嗜酸性慢性鼻窦炎伴鼻息肉和对照组,嗜酸性慢性鼻窦炎伴鼻息肉和非嗜酸性慢性鼻窦炎伴鼻息肉之间找到了26个基因表现出差异的DNA羟甲基化。最后,研究发现INPP4A是嗜酸性慢性鼻窦炎鼻息肉的生物标记物。爱基百客为其提供hMeDIP-seq的技术支持


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01

研究背景


慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)是一种多因素、异质性和社会经济负担沉重的鼻腔和鼻窦炎症性疾病。嗜酸性CRSwNP (ECRSwNP)和非嗜酸性CRSwNP (NECRSwNP)是CRSwNP的两种内分型,它们具有不同的免疫病理模式,并通过嗜酸性粒细胞浸润的程度来区分。嗜酸性慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(ECRSwNP)是慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉的一种内型,其症状更严重,与哮喘的相关性更强,复发风险更大。目前尚不清楚DNA羟甲基化是否会影响ECRSwNP。

02

研究方


对3组(对照、ECRSwNP和NECRSwNP)病人进行羟甲基化DNA免疫沉淀测序,其中对照组取中鼻甲黏膜,ECRSwNP和NECRSwNP组取鼻息肉。

03

研究思路

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04

研究结果



01

采用hMeDIP-Seq技术的病人特征


表1统计汇总了参与hMeDIP-Seq病人的特征。hMeDIP-seq总共对9名参与者进行了测试,每组有3名参与者。所有参与者都没有哮喘、过敏性鼻炎、阿司匹林耐受不良或鼻部手术史。ECRSwNP患者外周血和组织嗜酸性粒细胞计数显著升高。影像学检查分数和VAS症状评分在ECRSwNP中呈上升趋势。

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02

ECRSwNP、非ECRSwNP及健康对照的DNA羟甲基化比较



hMeDIP-Seq生成了鼻息肉中5hmC分布的表基因组图谱(图1A)。在ECRSwNP和NECRSwNP之间共有36个差异羟甲基化区域(DhMRs),包括ECRSwNP中的10个高羟甲基化区域和26个低羟甲基化区域(图1B)。作者随后研究了DhMRs在基因体中的分布(图1C)。
基于ECRSwNP和NECRSwNP间DhMRs的注释和修饰,共鉴定出26个DhMGs(表2)。3个基因(CCL7、SEL1L2和OXCT1-AS1)在启动子区被发现存在差异羟甲基化,而其余23个基因在基因体中被发现存在差异羟甲基化。
与对照相比,在ECRSwNP中发现了273个DhMRs和169个dhmg,其中23个基因的启动子区存在差异峰。在NECRSwNP与对照之间仅检测到一种DhMG,即DACH2。


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图1 嗜酸性与非嗜酸性慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉的DNA羟甲基化比较


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03

差异羟甲基化基因功能分析


作者利用UniProt和 PubMed 数据库分析ECRSwNP和NECRSwNP之间的26DhMGs的生物学功能。综合考虑差异羟甲基化元件、DhMGs的生物功能和ECRSwNP的特性,共选择9个基因进一步验证与ECRSwNP形成相关的遗传变化(表3)。除了INPP4A、CCL7和IRF4(已被证明与炎症反应有关),SEL1L2、GNAL、ZNF423、SLC254A、DCLK2和KANK1可能影响嗅觉功能和神经传导和发育。两个基因(CCL7和SEL1L2)在其启动子区存在差异羟甲基化。


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04

纳入验证实验的病人特征


表4总结了纳入后续实验验证的病人的实验、临床特征等。ECRSwNP组由4名哮喘受试者和2名过敏性鼻炎患者组成。ECRSwNP组和NECRSwNP组均包括4名过去曾接受鼻息肉切除术的患者。ECRSwNP患者外周血和组织嗜酸性粒细胞计数显著升高。除E/M比和面部疼痛或头痛评分外,其他影像学检查评分和VAS评分在ECRSwNP患者中明显更高。


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05

通过qRT-PCR确认基因表达变化少


与其他两组样本相比,ECRSwNP患者样本中INPP4A和IRF4 mRNA表达水平明显降低,而GNAL mRNA表达水平显著升高(图2A-C)。虽然与对照组相比,ECRSwNP和NECRSwNP中CCL7和SEL1L2的mRNA表达水平显著升高,但两组之间没有差异。所选DhMGs在哮喘型ECRSwNP患者与单纯ECRSwNP患者或有鼻息肉切除史的ECRSwNP患者与无鼻息肉切除史的ECRSwNP患者之间的mRNA水平均无统计学差异。

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图2 采用qRT-PCR方法检测对照组和鼻息肉嗜酸性和非嗜酸性慢性鼻窦炎患者鼻息肉黏膜组织中所选差异羟甲基化基因的相对表达



06

免疫组化证实基因表达变化

     

    免疫组化染色检测GNAL、INPP4A、IRF4蛋白表达水平。GNAL免疫组化染色显示小血管内皮细胞呈强阳性,炎性细胞和血管周围上皮细胞呈弱阳性。与其他两组相比,ECRSwNP组中GNAL阳性细胞明显增多(图3A)。INPP4A主要在上皮细胞和粘膜下炎症细胞阳性。在ECRSwNP样本中,阳性染色细胞的数量可以忽略不计(图3B)。IRF4主要在上皮细胞和粘膜下炎症细胞阳性。与其他两组相比,NECRSwNP染色阳性细胞明显增多(图3C)。


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图3 免疫组化染色


07

mRNA表达与实验和临床特征之间的关联


    外周血嗜酸性粒细胞百分比、组织嗜酸性粒细胞计数、血管总得分和前筛窦评分与GNAL mRNA水平极显著正相关。外周血嗜酸性粒细胞、组织嗜酸性粒细胞计数、VAS总分、鼻塞评分、嗅觉评分、前筛窦评分和后筛窦评分与INPP4A mRNA水平显著相关。IRF4 mRNA水平仅与后筛窦评分相关(表5)。

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08

DhMGs ' mRNA对ECRSwNP的预测价值


在以往的研究中,外周血嗜酸性粒细胞百分比已成功应用于ECRSwNP预测。在该研究中,作者把这个参考引入。根据回归分析, 可以用INPP4A mRNA,GNAL mRNA和外周血嗜酸性粒细胞百分比预测ECRSwNP(图4A)。对受试者工作特征曲线的进一步分析显示,只有GNAL mRNA作为预测因子表现较差。为确定INPP4A mRNA和GNAL mRNA是否能提高外周血嗜酸性粒细胞百分比的预测价值,作者构建并评估了3种联合模型。外周血嗜酸性粒细胞百分率与INPP4A mRNA或GNAL mRNA联合测定提高了外周血嗜酸性粒细胞百分率的准确性和特异性。


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图4  
二元逻辑回归分析和接受者工作特征分析


09

低&高INPP4A组患者特点比较


     根据INPP4A mRNA预测模型的cutoff值0.4,来源于原始CRSwNP病人分为两组:低INPP4A水平组(values<0.4;n=20)和高INPP4A水平组(values ≥0.4;n=12)。低水平INPP4A水平组(n=15;75%)ECRSwNP发病率高于高INPP4A水平组(n=1;8.33%)(p=0.0006;图5A)。比较两组的人口统计学特征,没有明显的差异(图5B-F)。Lund-Kennedy内镜评分中外周血嗜酸性粒细胞百分比、组织嗜酸性粒细胞计数、鼻阻塞评分、黏膜水肿评分,Lund-Mackay CT评分中前筛窦评分和后筛窦评分在低INPP4A水平中明显更低(图6A-D)。值得注意的是,E/M比值原组间无差异,在低INPP4水平组显著更高(图6E&F)。这些结果再次证明了INPP4A对ECRSwNP具有显著的预测价值。


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图5  比较低和高INPP4A组的人口统计学特征,预测截止值区分两组


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图6  低、高INPP4A组实验室及临床特征比较,预测截止值区分两组


05

研究结论



在该研究中,采用hMeDIP-Seq评估和比较了ECRSwNP和NECRSwNP鼻息肉的DNA羟甲基化,hMeDIP-Seq是最广泛使用和有效的全基因组5-羟甲基胞嘧啶分析方法。该研究表明DNA羟甲基化可能通过调控GNAL、INPP4A和IRF4等多个基因在问题鼻息肉中的表达参与了ECRSwNP的发病机制。基于研究发现,作者认为INPP4A是ECRSwNP的一个新的预测因子,并估计INPP4A可能与ECRSwNP的开始、进展和严重程度有关。



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