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公司总员工已达到百余人,其中95%以上具有学士学位,40%以上具有硕士及以上学位,专职科研人员20余人,专职销售人员30余人,覆盖全国90%的省市,核心成员来自国内知名高效、基因测序公司、信息分析公司等。

公司运营至今销售额累积1亿左右,成为国内成长最迅速的二代测序与生物科研服务企业之一。




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客户文章 | 骨质疏松症中竞争性内源RNA调控网络的综合分析

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发表单位:大连医科大学药学院

发表日期:2022年6月9日

期    刊:Scientifc Reports(IF:4.996)

研究材料:大鼠股骨


2022年6月9日,大连医科大学药学院孙慧君教授团队在期刊Scientifc Reports(IF:4.996)发表题为“The integrative analysis of competitive endogenous RNA regulatory networks in osteoporosis”的研究论文。该研究利用GEO数据库分析了骨质疏松症病人的表达谱,鉴定得到了差异表达基因(DEGs)、差异表达miRNAs(DEMs)和差异表达circRNAs(DECs)并对它们的功能进行分析。随后,作者通过RNA-seq分析验证目的基因在ceRNA网络中的差异表达。最后,通过构建药物靶标基因网络,RKI-1447、FRAX486、玻尿酸和Fostamatinib被确定为OP的治疗选择。该研究试图更好地了解骨质疏松症(OP)的ceRNA相关发病机制,有助于提高骨质疏松症的诊断和治疗水平。


爱基百客为该研究提供RNA-seq的技术支持。



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01

研究背景



骨质疏松症(Osteoporosis, OP)是一种常见的老年骨病,是由骨吸收与骨形成不平衡引起的。其是全身性和代谢性骨骼疾病,以骨量和骨强度的普遍损伤为特征,最终导致脆性骨折。随着世界人口的老龄化,骨质疏松的发病率迅速增加,对骨质疏松的发病机制及相关药物的研究变得十分必要。CircRNAs是一类参与基因调控的内源性非编码RNA (non-coding RNAs, ncRNAs),可能在OP的发生发展中发挥重要作用。



02

研究方法



使用TRIzol试剂从6只大鼠(3只切除卵巢和3只健康对照)股骨中提取总RNA。


03

研究思路


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研究流程图


04

研究结果


01

骨质疏松中的DEGs、DEMs和DECs的鉴定


该研究的数据集包括3个芯片数据集(GSE116925、GSE35956和GSE156508)。circRNAs、miRNAs和mRNAs相关的基本信息列在表1。芯片数据的DEGs(差异表达基因)、DEMs(差异表达miRNAs)和DECs(差异表达 circRNAs)的火山图和热图在图2展示。利用分析工具以及韦恩图,找到了104个mRNAs定义为DEGs,41个miRNAs定义为DEMs。其中circRNAs,作者从数据集GSE161361中获得了10个DECs(图3)。



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表1 GEO微阵列数据集的基本信息


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图2 微阵列数据集的火山图和热图


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图3 DEGs、DEMs和DECs的鉴定


02

靶miRNAs和靶基因的鉴定,circRNA-miRNA-mRNA网络的构建


通过交叉从GEO数据中获得的靶标circRNAs预测的靶miRNAs和DEMs,作者最终确认了5个OP相关的靶miRNAs(图4A)。使用miRWalk和TargetScan网站预测的mRNAs可以与靶miRNAs结合。然后,通过将预测的mRNAs和DEGs交互,去除重复后确认38个靶基因(图4B-F)。最后,利用Cytoscape软件生成包含circRNA-miRNA和miRNA-mRNA的circRNA-miRNA-mRNA网络(图4G),基于GEO数据中基因的表达数据绘制38个目标基因的热图(图5)。


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图4 靶miRNAs和靶基因的鉴定,构建circRNA-miRNA-mRNA网络


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图5 circRNA-miRNA-mRNA网络中38个靶基因的热图


03

靶基因、靶miRNAs和DECs的功能富集分析


利用Metascape网站和R包对靶基因进行功能富集分析,如图6A和6B,靶基因富集分析结果显示它们主要富集在骨质疏松症相关的“MAPK级联”、“细胞响应激素刺激的反应”、“氧化还原酶活性的调控”等,这揭示了靶基因可能通过这些信号通路影响骨质疏松症的发生。

由于circRNAs是一种新型非编码RNA,它们功能仍未能很好地解释,不能直接对DECs进行功能分析。作者推测DECs的宿主基因,转录circRNAs的前体RNAs,在ceRNA网络中发挥重要作用,对宿主基因的分析可以揭示DECs的潜在机制。如图6C,宿主基因的富集分析主要富集于疏松症相关的项目“钙粘着蛋白结合”、“rRNA甲基转移酶活性”和“细胞响应氧化型低密度脂蛋白”等。

利用DIANA工具网站的mirPath v.3工具对靶miRNAs进行富集分析。MiRPath是一种miRNA通路分析web-server,通过相应的靶基因间接对miRNA进行富集分析。如图6D和E,富集分析结果主要富集于“PI3K-Akt信号通路”、“维生素消化吸收”、“Tyroid激素信号通路”和“细胞死亡”等骨质疏松相关条目。

以上富集分析结果均为OP相关项,说明靶基因、靶miRNAs和DECs与OP密切相关。


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图6 靶基因、靶miRNAs和DECs的富集分析


04

靶基因的RNA-seq验证


为了进一步分析目的基因与骨质疏松症的关系,验证公共数据库导出的DEGs的可靠性,作者建立去卵巢大鼠骨质疏松模型,通过RNA-seq分析骨质疏松大鼠与正常大鼠之间的差异表达基因(图7A)。骨质疏松症大鼠和对照组间发现了1422个mRNAs差异表达(图7B),其中878个上调mRNAs和544个下调。此外,通过比较RNA-seq和GEO数据库的差异表达mRNA,作者发现从RNA-seq中获得的差异表达mrna,去除重复mrna后,约30%的差异表达mRNA还存在于GEO数据库中(图7C)。比较差异表达基因的表达水平,分析富集的通路,结果显示RNA-seq生成的DEGs与GEO数据集得到的DEGs具有较好的一致性,目标基因MFAP5、CAMK2A和RGS4与OP密切相关。


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图7 目的基因的RNA-seq验证


05

PPI网络建立,靶基因的hub基因鉴定


为了探索靶基因编码的蛋白质之间的相互作用,作者构建了一个蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。32个节点和74条边映射到PPI网络(图8A)。Cytoscape软件中的Cytohubba APP用于鉴定hub基因,其在PPI网络中更为重要且是一个包含5个节点(DIRAS2、CAMK2A、MAPK4、CDC42BPA和RGS4)和10条边的重要模块(图8B)。基于这5个hub基因的构建circRNA-miRNA-hub基因亚网络,以供进一步研究(图8C)。


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图8 目的基因PPI网络的建立和hub基因的鉴定


06

相关的靶RNAs的qRT-PCR分析


为了进一步验证相关靶RNAs和骨质疏松症的关系,作者在同样的12例人骨组织中分析了ceRNA亚网络中靶标环状RNA、靶标miRNAs和靶标mRNAs与成骨指标OPG之间的相关性。如果9A-K,hsa_circ_0028877、hsa_circ_0082916、hsa_circ_0030712、DIRAS2、CAMK2A、MAPK4的表达与成骨显著相关。通过mRNA-circRNA的相关分析作者判断CAMK2A和DIRAS2的表达均与hsa_circR_0028877的表达呈正相关(图9L-M)。在人骨组织中miRNA-mRNA相关性分析中,作者发现hsa-miR-1273f与靶基因CAMK2A和DIRAS2负相关(图9N-O),这一结论也可以通过在人骨髓间充质干细胞中使用抑制剂抑制hsa-miR-1273f来验证(图9P)。


    总之,hsa_circR_0028877/hsa-miR-1273f/CAMK2A和hsa_circR_0028877/h

samiR-1273f/DIRAS2的表达符合ceRNA机制的特征。



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图9 qRT-PCR分析ceRNA亚网络中环状rna、miRNAs和mrna与成骨指标OPG的相关性


07

潜在药物的鉴定和药物靶基因相互作用网络的构建


为了通过靶基因寻找可能的骨质疏松症疗效的药物,作者将ceRNA网络中的38个靶基因上传到Drugbank、TTD和CLUE数据库中,获得62种候选化合物。然后,作者构建了药物-靶基因互作网络,并将其可视化(图10 A)。此外,如图10B所示,为了进一步筛选候选化合物,作者构建了包含同时靶向多个靶基因的药物的亚网络,筛选出4种药物:RKI-1447、FRAX486、透明质酸和Fostamatinib(图10C-F)。

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图10  潜在药物的识别和药物靶基因相互作用网络和亚网络的构建


05

研究结论


通过综合生物信息学分析和实验验证,作者构建了circRNA-miRNA-mRNA网络,发现hsa_circ_0028877、hsa_circ_0082916、hsa_circ_0030712、DIRAS2、CAMK2A和MAPK4与成骨显著相关,hsa_circR_0028877/hsa-miR-1273f/CAMK2A轴和hsa_circR_0028877/hsa-miR-1273f/DIRAS2轴可能作为ceRNA机制在骨质疏松中发挥关键作用。另外,4个生物活性的化学物质(RKI-1447、FRAX486、透明质酸和Fostamatinib)确定为骨质疏松症的潜在治疗药物。


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