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客户文章 | 骨质疏松症中竞争性内源RNA调控网络的综合分析
发表单位：大连医科大学药学院 发表日期：2022年6月9日 期 刊：Scientifc Reports（IF:4.996） 研究材料：大鼠股骨 2022年6月9日，大连医科大学药学院孙慧君教授团队在期刊Scientifc Reports（IF:4.996）发表题为“The integrative analysis of competitive endogenous RNA regulatory networks in osteoporosis”的研究论文。该研究利用GEO数据库分析了骨质疏松症病人的表达谱，鉴定得到了差异表达基因（DEGs）、差异表达miRNAs（DEMs）和差异表达circRNAs（DECs）并对它们的功能进行分析。随后，作者通过RNA-seq分析验证目的基因在ceRNA网络中的差异表达。最后，通过构建药物靶标基因网络，RKI-1447、FRAX486、玻尿酸和Fostamatinib被确定为OP的治疗选择。该研究试图更好地了解骨质疏松症（OP）的ceRNA相关发病机制，有助于提高骨质疏松症的诊断和治疗水平。 爱基百客为该研究提供RNA-seq的技术支持。
01 研究背景 骨质疏松症(Osteoporosis, OP)是一种常见的老年骨病，是由骨吸收与骨形成不平衡引起的。其是全身性和代谢性骨骼疾病，以骨量和骨强度的普遍损伤为特征，最终导致脆性骨折。随着世界人口的老龄化，骨质疏松的发病率迅速增加，对骨质疏松的发病机制及相关药物的研究变得十分必要。CircRNAs是一类参与基因调控的内源性非编码RNA (non-coding RNAs, ncRNAs)，可能在OP的发生发展中发挥重要作用。 02 研究方法 使用TRIzol试剂从6只大鼠(3只切除卵巢和3只健康对照)股骨中提取总RNA。 03 研究思路
研究流程图 04 研究结果 01 骨质疏松中的DEGs、DEMs和DECs的鉴定 该研究的数据集包括3个芯片数据集（GSE116925、GSE35956和GSE156508）。circRNAs、miRNAs和mRNAs相关的基本信息列在表1。芯片数据的DEGs（差异表达基因）、DEMs（差异表达miRNAs）和DECs（差异表达 circRNAs）的火山图和热图在图2展示。利用分析工具以及韦恩图，找到了104个mRNAs定义为DEGs，41个miRNAs定义为DEMs。其中circRNAs，作者从数据集GSE161361中获得了10个DECs（图3）。
图2 微阵列数据集的火山图和热图
图3 DEGs、DEMs和DECs的鉴定 02 靶miRNAs和靶基因的鉴定，circRNA-miRNA-mRNA网络的构建 通过交叉从GEO数据中获得的靶标circRNAs预测的靶miRNAs和DEMs，作者最终确认了5个OP相关的靶miRNAs（图4A）。使用miRWalk和TargetScan网站预测的mRNAs可以与靶miRNAs结合。然后，通过将预测的mRNAs和DEGs交互，去除重复后确认38个靶基因（图4B-F）。最后，利用Cytoscape软件生成包含circRNA-miRNA和miRNA-mRNA的circRNA-miRNA-mRNA网络（图4G），基于GEO数据中基因的表达数据绘制38个目标基因的热图（图5）。
图4 靶miRNAs和靶基因的鉴定，构建circRNA-miRNA-mRNA网络
图5 circRNA-miRNA-mRNA网络中38个靶基因的热图 03 靶基因、靶miRNAs和DECs的功能富集分析 利用Metascape网站和R包对靶基因进行功能富集分析，如图6A和6B，靶基因富集分析结果显示它们主要富集在骨质疏松症相关的“MAPK级联”、“细胞响应激素刺激的反应”、“氧化还原酶活性的调控”等，这揭示了靶基因可能通过这些信号通路影响骨质疏松症的发生。 由于circRNAs是一种新型非编码RNA，它们功能仍未能很好地解释，不能直接对DECs进行功能分析。作者推测DECs的宿主基因，转录circRNAs的前体RNAs，在ceRNA网络中发挥重要作用，对宿主基因的分析可以揭示DECs的潜在机制。如图6C，宿主基因的富集分析主要富集于疏松症相关的项目“钙粘着蛋白结合”、“rRNA甲基转移酶活性”和“细胞响应氧化型低密度脂蛋白”等。 利用DIANA工具网站的mirPath v.3工具对靶miRNAs进行富集分析。MiRPath是一种miRNA通路分析web-server，通过相应的靶基因间接对miRNA进行富集分析。如图6D和E，富集分析结果主要富集于“PI3K-Akt信号通路”、“维生素消化吸收”、“Tyroid激素信号通路”和“细胞死亡”等骨质疏松相关条目。 以上富集分析结果均为OP相关项，说明靶基因、靶miRNAs和DECs与OP密切相关。
图6 靶基因、靶miRNAs和DECs的富集分析 04 靶基因的RNA-seq验证 为了进一步分析目的基因与骨质疏松症的关系，验证公共数据库导出的DEGs的可靠性，作者建立去卵巢大鼠骨质疏松模型，通过RNA-seq分析骨质疏松大鼠与正常大鼠之间的差异表达基因（图7A）。骨质疏松症大鼠和对照组间发现了1422个mRNAs差异表达（图7B），其中878个上调mRNAs和544个下调。此外，通过比较RNA-seq和GEO数据库的差异表达mRNA，作者发现从RNA-seq中获得的差异表达mrna，去除重复mrna后，约30%的差异表达mRNA还存在于GEO数据库中（图7C）。比较差异表达基因的表达水平，分析富集的通路，结果显示RNA-seq生成的DEGs与GEO数据集得到的DEGs具有较好的一致性，目标基因MFAP5、CAMK2A和RGS4与OP密切相关。
图7 目的基因的RNA-seq验证 05 PPI网络建立，靶基因的hub基因鉴定 为了探索靶基因编码的蛋白质之间的相互作用，作者构建了一个蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。32个节点和74条边映射到PPI网络（图8A）。Cytoscape软件中的Cytohubba APP用于鉴定hub基因，其在PPI网络中更为重要且是一个包含5个节点（DIRAS2、CAMK2A、MAPK4、CDC42BPA和RGS4）和10条边的重要模块（图8B）。基于这5个hub基因的构建circRNA-miRNA-hub基因亚网络，以供进一步研究（图8C）。
图8 目的基因PPI网络的建立和hub基因的鉴定 06 相关的靶RNAs的qRT-PCR分析 为了进一步验证相关靶RNAs和骨质疏松症的关系，作者在同样的12例人骨组织中分析了ceRNA亚网络中靶标环状RNA、靶标miRNAs和靶标mRNAs与成骨指标OPG之间的相关性。如果9A-K，hsa_circ_0028877、hsa_circ_0082916、hsa_circ_0030712、DIRAS2、CAMK2A、MAPK4的表达与成骨显著相关。通过mRNA-circRNA的相关分析作者判断CAMK2A和DIRAS2的表达均与hsa_circR_0028877的表达呈正相关（图9L-M）。在人骨组织中miRNA-mRNA相关性分析中，作者发现hsa-miR-1273f与靶基因CAMK2A和DIRAS2负相关（图9N-O），这一结论也可以通过在人骨髓间充质干细胞中使用抑制剂抑制hsa-miR-1273f来验证（图9P）。 总之，hsa_circR_0028877/hsa-miR-1273f/CAMK2A和hsa_circR_0028877/hsamiR-1273f/DIRAS2的表达符合ceRNA机制的特征。
图9 qRT-PCR分析ceRNA亚网络中环状rna、miRNAs和mrna与成骨指标OPG的相关性 07 潜在药物的鉴定和药物靶基因相互作用网络的构建  图10 潜在药物的识别和药物靶基因相互作用网络和亚网络的构建 05 研究结论 通过综合生物信息学分析和实验验证，作者构建了circRNA-miRNA-mRNA网络，发现hsa_circ_0028877、hsa_circ_0082916、hsa_circ_0030712、DIRAS2、CAMK2A和MAPK4与成骨显著相关，hsa_circR_0028877/hsa-miR-1273f/CAMK2A轴和hsa_circR_0028877/hsa-miR-1273f/DIRAS2轴可能作为ceRNA机制在骨质疏松中发挥关键作用。另外，4个生物活性的化学物质（RKI-1447、FRAX486、透明质酸和Fostamatinib）确定为骨质疏松症的潜在治疗药物。 |
