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前沿技术 | Nature发表 Spatial-ATAC-seq技术，描绘小鼠和人体组织中染色质可及性的空间图谱

空间转录组技术今年被《Nature Methods》评为年度技术，它已晋升为生物技术研究领域冉冉升起的新星。2022年8月17日，耶鲁大学的樊荣教授团队于Nature在线发表文章“Spatial profiling of chromatin accessibility in mouse and human tissues”，对染色质可及性在整个基因组尺度进行空间测序，该技术可谓空间表观组学上的重大突破。该技术实现了空间分辨染色质可及性分析，提高了我们对细胞特性、细胞状态和细胞命运决定的理解，这些与发育和疾病的表观遗传密切相关。今天小编为大家带来空间ATAC-seq技术的重点内容。

概要

单细胞测序为定义细胞类型和状态提供了一种切实可行的方法，但在组织解离的过程中导致空间信息的丧失。此外，单细胞技术的解离方法可能优先选择某些细胞类型或者在解离过程中或其他环境压力会扰乱细胞状态。空间转录组的出现解决了这些挑战，并改变了我们在组织环境中描述细胞功能和状态的方式。目前，基因组尺度和细胞水平上在组织切片上绘制表观遗传状态（如染色质可及性）的能力是缺乏的。

本研究利用了一种空间条形码技术，通过Tn5转位将DNA寡聚体插入到开放的基因组位点实现spatial-ATAC-seq：在细胞水平绘制组织中染色质可及性的高分辨率全基因组图谱。小鼠胚胎的结果描绘了与中枢神经系统发育有关的区域特异性表观遗传景观和基因调控因子。作者还将空间表观基因组学应用于人组织，包括扁桃体和海马体。Spatial-ATAC-seq反映了淋巴滤泡和滤泡外免疫细胞类型和状态的不同组织。该技术为空间生物学增加了一个新维度，将空间染色质可及性带入该领域，可能为正常发育和发病机制的研究中提供广泛的应用。

空间ATAC-seq的设计和流程

在固定的组织切片上进行Tn5转位，将包含结扎连接子的适配器插入开放的基因组位点。然后，利用微通道引入带连接子的条形码A (A1-A50)和B (B1-B50)，通过连续轮连接连接到Tn5寡核苷酸的5 '端，得到不同的组合。对组织切片进行成像，使空间条形码可接近的染色质可以与组织形态学相关联。

空间ATAC-seq工作流程和微流控横流式的方案

为了获得高产量和高信噪比，作者在对实验方案进行多次调整，将优化方案应用于不同的组织类型，并评估数据质量。在50 μm E13小鼠胚胎实验中，总分析准确再现了bulk测量结果（图1d）。此外，作者将spatial-ATAC-seq结果（不同分辨率）与10x scATAC-seq的测序结果比较（图1e-i），结果表明数据质量可以达到同样的水平。

图1 Spatial-ATAC-seq设计、工作流程和数据质量

E13小鼠胚胎的空间图谱

作者试图利用空间ATAC-seq技术从E13的小鼠胚胎中鉴定新的细胞类型。无监督聚类识别了8个主要的聚类，揭示了不同的空间类型，这与组织学的结构一致（图2a-c）。簇1代表着胎儿肝脏，簇2是特异指向脊柱区域，其包括带有Sox10开放染色质的背根神经节（DRG）；簇3到簇5与周围神经系统和中枢神经系统相关；簇6包括几种存在于发育肢体中的细胞类型，簇8包括几个发育中的内部器官。

图2a-c 小鼠E13胚胎的空间染色质可及性定位

为了基准测试spatial-ATAC-seq数据，作者将ENCODE数据库中器官特异的ATAC-seq数据投射到他们的UMAP。总体而言，鉴定的聚类与bulk ATAC-seq的投射匹配良好，并且区分所有主要的发育组织和器官（bulk数据和空间ATAC-seq数据之间的一些不一致可能归因于像素中包含多种细胞类型）。作者进一步检查细胞类型特异性标记基因，确定为簇间差异，并根据给定位点的总体信号，从染色质可及性中估计这些基因的表达（图2c）。

除了推断细胞类型特异性标记基因外，作者的方法还能够识别细胞类型特异的染色质调控元件，提供了用于将调控元件定义为细胞类型特异性报告器的资源。作者使用转录因子motif的偏差来检查细胞类型特异性转录因子调控因子，并发现在胚胎肝脏中更容易接近的peaks中最丰富的motif对应于GATA转录因子，这与充分研究过的红细胞分化结果一致。

图2d-f 小鼠E13胚胎的空间染色质可及性定位

作者随后将spatial-ATAC-seq数据与单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据联合，给每个簇分配细胞类型（图2d-f）。例如，明确的红细胞主要出现在肝脏中，中胚层位于内脏区，放射状胶质细胞主要分布在中枢神经系统。精细的聚类过程也使兴奋性神经元中具有不同空间分布、marker基因和染色质调节元件的亚群的识别成为可能。

E11 小鼠胚胎的空间图谱

为了进一步绘制小鼠胚胎发育过程中染色质可及性的图谱，作者对早期阶段(E11)的小鼠胚胎进行了分析，并确定了4个具有不同空间模式的簇，这与解剖结果很好地吻合。此外，识别的簇与ENCODE器官特异的bulk ATAC-seq投射到UMAP匹配。作者进一步调查了区分的簇的染色质可及性。例如，Slc4a1是红细胞膜正常柔韧性和稳定性以及正常红细胞膜形状所必需的，它在肝脏和AGM中是高度可接近性的。此外，随着空间分辨率的增加（20 μm），spatial-ATAC-seq能够分辨更多的细胞类型，比如簇3中发现的一层薄薄的脊索细胞。

为了更直接地评估发育过程中染色质可及性的时间动态，作者确定了从E11到E13小鼠胚胎在胎儿肝脏和兴奋性神经元内可及性的显著变化的动态峰。作者观察到不同发育阶段的胎儿肝脏和兴奋性神经元可及性存在显著差异。特别地，胎儿肝脏E13的染色质可及性图谱显示富集GATA motif序列，它是在红细胞分化中扮演重要角色的知名转录因子。此外，EGR1 motif富集于E13的兴奋性神经元，其在大脑发育过程中具有功能意义，特别是兴奋性神经元的特性。

小鼠和人大脑的空间图谱

为了进一步基准测试和整合spatial-ATAC-seq数据与可用的scATAC-seq和scRNA-seq数据集，作者将空间ATAC-seq图谱应用于bregma1 的P21 小鼠冠状切片（图3a）。尽管使用7-氨基放线菌素D（7-AAD）核染色仅分辨出侧脑室的轮廓（图3b），但无监督聚类鉴定出7个具有独特空间分布的聚类，揭示了这个大脑区域的复杂区域化（图3c,d）。这些聚类在marker基因区域内显示出独特的可及性（FDR<0.05，log2[FC]≥0.1）：兴奋性神经元（Khdrb3，簇1）、中棘神经元（Pde10a，簇2）、外侧隔核（Dgkg，簇4）、胼胝体富含少突胶质细胞（Mobp，簇6）和心室区富含星形室管膜细胞（Fgfr3，簇7）（图3e）。将空间ATAC序列数据与scATAC序列图谱集进行整合和共嵌入，验证了聚类的一致性。

图3 20μm像素下P21小鼠大脑的空间染色质开放性图谱以及整合分析

为了进一步研究该技术在不同物种间的性能，作者接下来在成人冠状脑切片（包括海马和脉络丛）上使用spatial-ATAC-seq技术。作者能鉴定到6个差异簇分布在整个组织切片上，随后将scATAC-seq数据集与之整合。这些结果共同证实了spatial-ATAC-seq基于染色质可及性模式在空间上分辨人脑组织内不同细胞群的能力。

人扁桃体的空间图谱

为了进一步证明在不同物种和组织类型中描绘空间染色质可及性的能力，作者将空间ATAC-seq应用于人类扁桃体组织。无监督聚类呈现出明显的空间特征，生发中心（GC, germinal centres）主要位于簇1（图4a-c）。作者随后检查了特异的marker基因的空间模式，以区分细胞类型，并将这些数据与扁桃体中蛋白质表达的分布进行比较。比如B细胞相关基因，成熟GC B细胞的标记基因CD10 的可及性就富集在GC区域。CXCR4在GC暗区的中心母细胞中表达，出乎意外地仅在非GC细胞中表现出高可及性。这种表观遗传状态和蛋白表达之间的不一致性可能暗示在进入GC前GC前体B细胞表观遗传启动。作者还检查了每个簇中细胞类型特异的转录因子，他们的数据表明KLF家族的转录因子高度富集在非GC细胞中，这与前人的研究结果一致。

为了将细胞类型映射到每个簇上，作者将空间ATAC-seq数据与scRNA-seq和scATAC-seq数据集联合（图4e）。为了定义scRNA-seq 簇的细胞身份，作者检查了每个簇的标记基因并发现簇0 包含原始B细胞，簇4 对应于GC B细胞，簇13是巨噬细胞，与组织学结果一致（图4f）。为了理解动态调节过程，作者对GC反应的B细胞激活进行了伪时序分析（图4g-i）。同时，每个像素的伪时间在空间坐标上的投影揭示了这个动态过程中空间上不同的区域。

图4 20μm像素大小的人类扁桃体的空间染色质可及性图谱

总结

该研究开发了spatial-ATAC-seq用于空间解析完整组织切片的染色质可及性，空间信息分辨率可以达到细胞水平（20 μm pixel）。通过使用免疫荧光成像识别像素可以达到仅包含一个核，可以在不分离组织的情况下获得单细胞染色质可及性。Spatial-ATAC-seq应用于小鼠胚胎（E11和E13）以描绘器官发生的表观遗传学景观；作者确定了具有不同染色质可及性状态的所有主要组织类型，并揭示了发育的时空变化。绘制小鼠和人类大脑中的开放基因组图谱，揭示了大脑区域的复杂化。作者也使用spatial-ATAC-seq绘制人类扁桃体中不同免疫细胞的表观遗传状态，并揭示了B细胞对GC反应的激活动力学，以及精细定位的自身免疫性GWAS基因变体的假定靶基因。

Spatial-ATAC-seq技术进一步发展的领域包括：

1. 通过增加条形码的数量（比如100×100）或蛇形微流体通道用于组织阵列，以进一步增加映射像素的数目；

2. 与单细胞技术不同，spatial-ATAC-seq的像素可能包括部分核或多个细胞核，并可能导致细胞混合，可能包括多种细胞类型，使数据解释复杂化。这一挑战可以通过使用细胞类型去卷积方法或高分辨率组织图像（多色免疫荧光图像）无缝集成来解决，以识别每个像素中的细胞。作者观察到大量像素（20μm）包含单核，这可以产生空间定义的scATAC-seq数据。

3. 转录组学和蛋白质组学等其他空间组学技术相结合，可以提供细胞类型和细胞状态的全面图像。

Spatial-ATAC-seq尚待进一步扩展到人类疾病患者的组织样本，以实现其在临床研究中的潜力。作者预计空间ATAC-seq将为空间生物学增加一个新的维度，从而能够以空间分辨的方式分析调控元件，这是空间转录组学或蛋白质组学无法实现的。空间ATAC-seq可能会改变多个生物医学研究领域，包括发育生物学、神经科学、免疫学、肿瘤学和临床病理学，从而增强人类健康和疾病的科学发现和转化医学。