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项目文章 | IF=10.323!Fng3 ING蛋白调控丝状真菌组蛋白H3、H4乙酰化动态平衡新机制

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发表单位:西北农林科技大学

发表日期:2022年6月2日

期刊:New Phytologist(IF=10.323)


2022年6月2日,西北农林科技大学植物保护学院江聪团队在期刊New Phytologist发表题为“The Fng3 ING protein regulates H3 acetylation and H4 deacetylation by interacting with two distinct histonemodifying complexes”的研究论文。该研究发现生长抑制因子蛋白Fng3通过结合NuA3组蛋白乙酰化复合体以及Rpd3组蛋白去乙酰化复合体以实现H3乙酰化和H4去乙酰化间的动态平衡。研究结果为揭示丝状真菌不同组蛋白修饰间的关系提供了新的视角。爱基百客为该研究提供了ChIP-seq的技术支持

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01

研究背景


组蛋白乙酰化的稳态水平由组蛋白乙酰转移酶 (HAT) 和组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 复合物维持。生长抑制剂 (ING) 蛋白是 HAT或HDAC复合物的关键成分,但它们与其他成分的关系以及在植物病原真菌中的作用尚不清楚。真菌中对此类蛋白的认知主要来源于酵母,对丝状真菌生长抑制因子蛋白的功能仍知之甚少。本研究鉴定了禾谷镰刀菌中的一个Fng3 基因,发现它通过与两种不同的组蛋白修饰复合物相互作用,在真菌发育和致病性的调节中起关键作用,此外,还提出了一种禾谷镰刀菌中ING 蛋白和组蛋白修饰复合物之间相互作用的新模型。



02

研究材料


野生型禾谷镰刀菌菌株PH-1

突变体菌株(fng1、fng2、fng3、Fgrpd3)


03

研究思路

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04

研究结果


1. Fng3是NuA3 HAT复合体的一部分



为了确定FNG2、FNG3与NuA3或NuA4复合物的关系,作者构建了FNG2-nYFP和FNG3-nYFP融合载体,并将它们与 FgSAS3-cYFP 或 FgESA1-cYFP 融合载体成对转入野生型菌株 PH-1进行BiFC实验。结果显示FNG3-nYFP和FgSAS3-cYFP同时表达时可在细胞核中观察到YFP信号,而其它处理中均未观察到YFP信号(图1a,b),表明Fng3仅与NuA3复合体核心亚基FgSas3相互作用,而Fng2、Fng3和NuA4复合物FgEsa1不存在相互作用。因此,Fng3可能在禾谷镰刀菌的NuA3复合物中扮演ING蛋白的角色



2. 在NuA3复合物中,FgNto1与FgSas3和Fng3相互作用



作者进行了酵母双杂交实验,结果显示Fng3与FgSas3不存在相互作用,这表明Fng3和FgSas3之间的相互作用可能需要NuA3复合物的其他成分。除此之外,Y2H结果显示Fng3与FgNto1、FgNto1与FgSas3均存在相互作用,与FgTaf14不存在相互作用(FgNto1和FgTaf14是禾谷镰刀菌中NuA3复合体的另外两个保守亚基)。

由此可知,FgNto1与FgSas3和Fng3 相互作用,这可能介导 NuA3复合物中的FgSas3-Fng3相互作用(图1c)。为了验证这一假设,作者在FNG3-nYFP FgSAS3-cYFP 转化体中敲除FgNTO1基因,结果发现突变体的生长速率降低,细胞核中无法观察到YFP信号,这表明FgNTO1的缺失破坏了禾谷镰刀菌中 FgSas3和Fng3之间的相互作用(图1d,e)。


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图1检测Fng3与NuA3组蛋白乙酰转移酶(HAT)复合物的关联

3. fng3缺失突变体在H3乙酰化方面存在缺陷



作者利用fng3 缺失突变体进一步验证其在 NuA3复合物中的作用。结果显示fng3缺失突变体的分生孢子形态是正常的,生长速率和分生孢子略有降低(图2a,b);它可以产生黑化的子囊,但无法形成成熟的子囊和子囊孢子(图2c)。

使用H3K4ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K27ac 、H3K36ac 特异抗体测定组蛋白H3的乙酰化,结果显示,与WT相比,fng3突变体的H3K4ac、H3K14ac、H3K36ac的乙酰化水平显著降低;fng2缺失突变体中H3乙酰化没有显著变化(图2d),进一步证实Fng3是禾谷镰刀菌中NuA3复合物的ING蛋白,而不是Fng2。


4. FNG3对于感染性生长的渗透和传播非常重要


在小麦侵染试验中,fng3 突变体菌株的毒力降低(图2e),它只能使小麦在接种的籽粒上引起FHB症状。脱氧雪腐镰刀菌烯醇具有植物毒性,是禾谷镰刀菌的重要毒力因子,可通过叶轴传播。fng3突变体菌株侵染的小麦籽粒中的DON(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)含量比野生型减少了5倍多(图2f)。扫描电子显微镜观察,fng3突变体在侵染垫形成过程中无明显缺陷(图2g)。然而,在小麦幼苗侵染试验中,fng3突变体只能在伤口附近的胚芽鞘细胞内进行有限的侵染性生长(图2h)。

为了进行互补分析,作者构建了FNG3-GFP载体,获得fng3/FNG3-GFP突变体,结果显示其在营养生长、有性繁殖和毒力方面都是正常的。这些结果表明,FNG3-GFP的表达完全互补于fng3突变体


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图2 禾谷镰刀菌中FNG3的功能验证


5. Fng3与Fng1共同调节营养菌丝中的基因集



RNA-seq结果显示,与WT相比,fng3突变体中共有2242个差异表达基因(DEG)的表达水平变化超过2倍。选择3个上调DEG和3个下调DEG进行qRT-PCR,结果与RNA-seq保持一致。此外,结果还显示Fgsas3突变体有1188个下调DEG,其中有365个在fng3突变体中的表达也降低;Fgsas3突变体中有1155个上调DEG,其中330个在fng3突变体中的表达水平增加(图3a),表明这些基因受到FgSAS3和FNG3的负调控

在fng3和Fgsas3突变体中下调的365个DEGs可能富含NuA3 HAT复合体的直接或间接靶标。ChIP-seq结果显示fng3和Fgsas3突变体中有365个共同DEGs在H3K14ac水平下调(附图1),这些基因中H3K14ac的高水平富集可能是由Fng3及其相关的NuA3 HAT复合物调节的。GO分析表明,它们富含参与核酸结合和转录调控的基因。


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附图1  fng3和Fgsas3突变体中下调的基因的 H3K14ac 富集和 GO 分析


前人研究发现fng1突变体中共有3546个DEG,fng3突变体中有1263个下调DEG,其中有502个在fng1突变体中的表达水平也降低;fng3突变体中有979个上调DEG,其中有243个在fng1突变体中中的表达水平增加(图3b),这表明在禾谷镰刀菌中Fng1和Fng3共同调节基因集。


6. FNG3的缺失也影响H4乙酰化



作者测定了fng3突变体在H4组蛋白中不同位点的乙酰化水平,结果显示四个赖氨酸残基的乙酰化水平都增加,其中H4K16的乙酰化水平最高,这表明NuA3复合物中FNG3的缺失导致H4乙酰化升高。此外,fng2突变体中也检测到H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac、H4K16ac乙酰化水平升高(图3c)。因此,Fng3和Fng2都参与了H4的乙酰化,但只有Fng3作为NuA3z组分对H3的乙酰化起重要作用。


7. Fng3与Rpd3 HDAC复合体有关


作者推测FNG3缺失对H4乙酰化的影响也可能由FgRpd3复合物介导。为了验证这一假设,首先分析了RNA-seq数据,发现fng3突变体中的1263和979个下调和上调的DEGs,分别有501和439个DEGs也在Fgrpd3突变体中下调或上调表达,这表明fng3突变体中40%以上的DEGs可能与FgRPD3共同调节。Fgrpd3和fng3突变体中有共同上调的439个DEGs的H4ac 富集度明显较低,这些基因中H4ac的低水平富集可能由Fng3及其相关的Rpd3 HDAC复合物维持。GO分析显示,它们富含参与黄素单核苷酸结合和代谢过程的基因(附图2)。


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附图2 fng3和Fgrpd3突变体中上调基因的H4ac富集和GO分析


随后作者构建了FNG3-GFP和FgRPD3-mCherry 载体,转入WT菌株PH1,通过DIC和荧光显微镜观察转化12h后的胚芽管中,在大多数细胞核中观察到GFP和mCherry信号(图3e),表明Fng3-GFP和FgRpd3-mCherry蛋白可能在细胞核中相互关联。随后通过BiFC验证了Fng3与FgRpd3的相互作用(图3f)。Fng3和FgSas3之间的相互作用是由FgNto1介导的,但酵母双杂交实验发现FgRpd3与FgNto1不存在相互作用。此外,当FgNTO1被敲掉时,FNG3-nYFP FgRPD3-cYFP转化体细胞核内仍然可以观察到YFP信号。这些结果表明,Fng3与FgRpd3的相互作用可能不依赖于FgNTO1,并且在功能上与FgRpd3 HDAC复合物的H4乙酰化有关。

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图3 Fng3与FgRpd3组蛋白去乙酰化酶(HDAC)复合物的结合用于调节H4去乙酰化和基因表达


8. ING结构域决定了Fng2和Fng3的功能特异性



在酵母中,Pho23是一种直接与Rxt2相互作用的ING蛋白,Rxt2是Rpd3 HDAC复合物的一个组分。禾谷镰刀菌基因组中有一个与酵母Rxt2不同的同源基因。为了检测Fng3是否通过与FgRxt2相互作用从而与FgRpd3复合物相关,作者进行酵母双杂交实验,结果显示Fng3和FgRxt2共转化时未能在SD-His平板上正常生长,即Fng3和FgRxt2不存在相互作用;Fng2和FgRxt2共转化时可以在SD-His平板上正常生长,即Fng2和FgRxt2存在相互作用(图4a)。因此,Fng2 与 FgRxt2 相互作用,可能影响禾谷镰刀菌中的 FgRpd3 复合物和 H4 乙酰化。Fng3必须与FgRpd3 HDAC复合体的其他组分相互作用。

对于真菌 ING 蛋白,已知 C 端 PHD 指结构域与组蛋白尾上的三甲基化赖氨酸结合,但 N 端 ING 结构域的作用尚不清楚。为了确定其在蛋白质-蛋白质相互作用中的作用,将Fng2和Fng3的N 端ING结构域进行交换,重新构建载体并进行酵母转化,结果显示FgRxt2和Fng3NT2共转化时能在SD-His平板上正常生长;FgRxt2 和Fng2NT3共转化不能在SD-His平板上正常生长(图 4b)。这些结果表明N末端区域决定了Fng2和Fng3蛋白与FgRxt2相互作用的特异性。

为了进一步表征Fng2和Fng3中ING结构域的功能,作者生成了FNG2ING3 等位基因,并将其转入fng2 突变体,其中 Fng2 的ING 结构域被 Fng3的结构域取代。所得转化体具有与fng2突变体相似的生长缺陷(图4c)。此外作者还生成了FNG2PHD3等位基因,并将其转入fng3突变体,其中Fng2的PHD区域被FNG3的区域取代。所得转化体在营养生长中是正常的(图4c),补充了fng3 突变体在营养生长中的缺陷(图4c)。因此,PHD 结构域可能负责 Fng2 和 Fng3 蛋白中的读取功能。然而,ING 结构域决定了它们与哪些蛋白质相互作用,以及它们与哪种蛋白质复合物相关。


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图4 Fng3和Fng2的生长抑制剂(ING)结构域的功能表征


9.FgRpd3的C端区域介导其与Fng3的相互作用


作者发现FgRpd3中有一个C端尾部区域,但在酵母Rpd3中不存在,来自其他丝状子囊菌的FgRpd3直系同源物,例如MoRpd3和NcRpd3,也具有C 末端尾部区域(图5a)。随后作者通过BiFC实验验证Fng3通过FgRpd3 C末端尾部区域与其相互作用(图5b、c)。此外,BiFC实验也验证了Fng3可以与MoRpd3、NcRpd3的C末端相互作用(图5d)。

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图5 FgRpd3 C端延伸在FgRpd3与Fng3互作中的作用

10. FgRpd3CT 固有无序区域的相分离可能有助于其与Fng3的结合


FgRpd3(FgRpd3CT)的C末端尾部散布着固有无序区域(IDR)(图6a)。为了检测FgRpd3CT的动力学,作者用FgRPD3CT-GFP转化体的菌丝进行了FRAP 测定。光漂白后,FgRpd3CT-GFP在几秒的时间内恢复荧光(图6b),表明 FgRpd3CT 可以进行相分离。

已知脂肪醇1,6-己二醇可抑制有利于相分离的弱疏水相互作用。为了在体内测试其对FgRpd3的影响及其与Fng3的相互作用,作者用5% 1,6-己二醇处理了 FgRpd3CT-nYFP FNG3-cYFP 转化体的胚芽,处理2小时后观察不到YFP信号。但1,6-Hex 处理并未破Fng2和FgRpd之间的相互作用。这些结果表明 FgRpd3CT 与Fng3的相互作用被1,6-己二醇破坏,这可能是由于其抑制FgRpd3CT IDR中的相分离以及与Fng3的弱疏水相互作用。

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图6 FgRpd3 C端延伸的相分离


05

总结

该研究鉴定了一个仅在子囊菌中存在的生长抑制因子Fng3通过Nto1与NuA3组蛋白乙酰化复合体核心亚基FgSas3互作,介导对组蛋白H3乙酰化的调控。RNA-seq、ChIP-seq和组蛋白乙酰化联合分析表明Fng3在调控H3乙酰化的同时,还参与了对组蛋白H4的去乙酰化调控。该研究发现丝状真菌的生长抑制因子与组蛋白修饰之间存在独特的互作与调控模式,为认识不同组蛋白修饰间的关系提供了新见解。

文献链接:https://pan.baidu.com/s/1-oIeJm2UtP1VwZZU9Zja2w(百度网盘)

提取码:5qm9


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