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项目文章 | ChIP-seq揭示Set2家族通过H3K36甲基化调控病原真菌黄曲霉的真菌毒素代谢和毒力

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发表单位:福建农林大学生命科学学院

发表期刊:Virulence(5.428)

发表时间:2022年8月9日

研究材料:黄曲霉菌(Aspergillus flavus)

2022年8月9日,福建农林大学生命科学学院汪世华教授团队在期刊Virulence(5.428)发表题为“Set2 family regulates mycotoxin metabolism and virulence via H3K36 methylation in pathogenic fungus Aspergillus flavus”的研究论文。该研究利用ChIP-seq分析,提出通过H3K36三甲基化,Set2甲基转移酶家族利用转录水平和底物利用水平控制真菌毒素的代谢。基百客为该研究提供ChIP-seq和ChIP-qPCR的技术支持。

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研究背景

黄曲霉以黄曲霉毒素感染各种作物,并适时地导致曲霉病。H3K36甲基化在真菌的次生代谢和毒力中起着重要作用,但H3K36甲基化对黄曲霉毒力的调控机制尚未见报道。作为一种新的组蛋白甲基转移酶(HMT),Set2通过其在酿酒酵母中的SET结构域催化H3K36的单、二和三甲基化,而最近的研究表明,H3K36的三甲基化是由Set2和Ash1(Set2家族)的催化活性引起的。考虑到Set2家族成员在维持常染色质位置的巨大影响,阐明Set2家族在致病性曲霉属次级代谢和毒力中的生物学功能至关重要。



研究思路

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研究结果

1. AshA在黄曲霉菌中保守,且是真菌形态建立所必需的

对16个曲霉属真菌的AshA蛋白构建进化树,结果显示这些曲霉属聚为一个大簇。蛋白结构域分析表明在这16个真菌中存在一个SET结构域。构建ashA缺失突变体(△ashA)、ashA互补株(Com-ashA),将这两个突变体在YES和PDA培养基上培养4d。△ashA菌株的分生孢子和分生孢子梗产量增加(图1 a)。qRT-PCR结果表明AshA存在会在48h时增加abaA的表达水平(图1b),48和72小时brlA表达水平显著升高(图1c)。这些结果表明AshA在YES培养基上负调控真菌的无性繁殖。

为了评估AshA在菌核(耐药结构)组装中的作用,将上述真菌菌株在CM培养基上点培养。用70%乙醇去除局部菌丝和分生孢子后,计数菌核。结果表明△ashA菌株中没有发现菌核(图1d)。通过qRT-PCR检测菌核调控基因nsdCnsdD的转录水平,结果发现在48和72小时nsdC的表达水平明显下降(图1e),nsdD在72小时也明显下调(图1f)。这些结果反映AshA在菌核发育中起着重要作用。

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图1 AshA在黄曲霉发育和生物合成中的作用


2. AshA在AFB1的生物合成中是必不可少的

将WT、△ashA和Com-ashA菌株在YES液体培养基中培养,测定其在黄曲霉素合成中的生物学功能,并于第6天收获菌丝并采用薄层色谱法分析。结果表明当AshA不存在时,AFB1的产量显著降低(图1g,h)。高效液相色谱分析进一步证实△ashA菌株几乎丧失了AFB1和AFB2的合成能力(图1i)。黄曲霉毒素合成基因及调控基因利用qRT-PCR监控,这些基因在72小时△ashA菌株中显著下调(图1j,k)。以上这些结果表明AshA通过正向调控相关生物合成基因簇来上调黄曲霉毒素的产生。


3. AshA在黄曲霉寄主毒力中起着重要作用

为了研究AshA在真菌对昆虫的毒力作用,给家蚕注射5μL(106/mL)来自黄曲霉菌WT、△ashA和Com-ashA菌株的分生孢子悬浮液,25度培养84小时。结果表明射ΔashA菌株孢子的蚕存活率明显高于注射WT和ComashA真菌菌株孢子的蚕(图2a,b)。收集WT、ΔashA和Com-ashA注射组的死蚕,在28度下的黑暗中进一步接种6d。此外,在WT和Com-ashA注射组的死蚕表面发现了明显更多的分生孢子(图2c),TLC分析显示ashA突变体显著抑制了受黄曲霉侵染的家蚕中AFB1的合成能力(图2d,e)。以上结果表明,AshA在黄曲霉对昆虫的毒力中起着重要作用

对玉米和花生谷粒进行了类似的实验,结果暗示AshA在黄曲霉对作物的毒力中起着重要作用(图2h,i)。家蚕和作物感染模型结果促使作者推测AshA的缺失可能提高ΔashA菌株对某些胁迫因素的敏感性。当菌株与CFW孵育时,第4天时ΔashA菌株抑制率明显高于WT和Com-ashA菌株(图2j,k),表明ashA缺失突变体更易受到细胞壁形成抑制剂的影响。当上述黄曲霉接种过氧化氢后,过氧化氢对ΔashA的抑制作用也明显增强(图2l,m)。
为了确认AshA是否在黄曲霉对CFW和过氧化氢介导的氧化应激的敏感性中发挥作用,菌株在一系列浓度梯度的PDA培养基中生长,观察生长情况。总的来说,这些结果表明AshA在CFW和过氧化氢的胁迫下发挥着关键作用,它可能通过提高真菌细胞壁抗性和真菌抗氧化作用来提高真菌对宿主的毒力。

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图2 AshA在黄曲霉对蚕和作物籽粒毒力中的作用,亚细胞定位及其催化的甲基化位点和水


4. AshA调节细胞核内的H3K36me2

为了探索AshA的亚细胞定位,作者制备了一个黄曲霉菌株(mCherry-AshA),它在AshA N端表达mCherry 标签。菌株在YES培养基中培养,菌丝在4(孢子萌发观察期)和12小时(菌丝观察期)收集,然后在DAPI(1 μg/mL)中孵育15分钟。利用共聚焦激光显微镜对样品进行观察,发现萌发期和菌丝生长期mCherry:AshA在每个细胞核中积累最多(图2n)。为了观察AshA在胁迫下是否发生易位,将mCherry-ashA菌株在5mM H2O2条件下培养12h。结果显示在氧化胁迫下AshA也主要在细胞核内积累(图2o)。

利用Western-blotting分析AshA作为甲基转移酶的酶促功能,将黄曲霉菌株制备的蛋白样品转移到NC膜上,用抗H3K4、H3K36和H3K79 1-3甲基化抗体进行检测,最终结果表明AshA主要催化H3K36me2(图2p,q)。


5. SET结构域在真菌毒力中起着重要作用

为了探索AshA的SET结构域生物功能,构建SET结构域突变体(ashA△SET)。突变体在YES培养基37度培养7天,结果显示出类似△ashA菌株的结果——更多菌丝,没有菌核形成。这个结果反映SET结构域在黄曲霉发育过程中扮演重要作用。另外,作者还通过实验发现SET结构域缺失对ashA的表达没有明显影响。

6. SetB主要催化核内H3K36的三甲基化

Set2甲基化转移酶家族包括Ash1和set2。鉴于上述研究结果表明AshA在真菌增殖和毒力中的关键调控作用,为了揭示整个set2家族在黄曲霉中的作用,该研究进一步探讨SetB的生物功能。生信分析结果也表明SetB在真菌中是保守的,特别是在曲霉属中。为了阐明SetB在致病真菌中的发育和毒力作用,作者构建setB缺失突变体(ΔsetB)和互补菌株(Com-setB)。为了探索AshA和SetB之间的协同作用,作者进一步构建了AshA和SetB基因双缺失菌株(ΔsetB/ashA)。同时构建了H3K36A点突变体(H3K36A),阐明了Set2家族的甲基化靶点。

为了揭示SetB在H3K36甲基化过程中的催化作用,作者采用免疫印迹法检测了WT、ΔsetB、Com-ΔsetB、setBΔSET、ΔsetB/ashA和H3K36A真菌菌株中H3K36的所有甲基化水平。结果表明,当setB基因缺失后,几乎没有检测到H3K36me3,这反映了SetB催化了大部分的H3K36me3(图3a)。当SET结构域缺失时,也观察到相同的结果,这一结果推断它是催化H3K36me3的关键因素。

与WT菌株相比,ΔsetB和setBΔSET菌株中均明显检测到更多的H3K36me1和me2,说明H3K36me1和me2由于不能及时转化为H3K36me3而积累。当setB和ashA基因同时被删除时,H3K36的所有甲基化水平都被消除,就像点突变株H3K36A一样(图3a,b),由于甲基化位置赖氨酸36已经突变为丙氨酸,所以不会发生甲基化。结果表明,这两个属于甲基转移酶的Set2家族蛋白负责黄曲霉H3K36的甲基化。

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图3 SetB在H3K36甲基化过程中的生物功能,以及SetB在黄曲霉发育、AFB1生物合成和毒力中的作用。

7. SetB在真菌毒力中的作用

作者将WT、ΔsetB 和Com-setB菌株在PDA培养基上点培养,生长结果显示SetB在真菌产孢和菌丝生长中具有重要作用。qRT-PCR结果显示当SetB被删除后,abaAbrlA的转录水平显著降低(图3h),说明SetB通过这些转录因子上调真菌的无性繁殖。在CM培养基中培养7天后,结果表明ΔsetB菌株的菌核严重减少(图3f,g),由此推断SetB对菌核形成至关重要。

进一步研究SetB在真菌毒素代谢中的作用,采用TLC(薄层色谱法)分析测定黄曲霉菌株AFB1的产生。在ΔsetB菌株中几乎没有检测到AFB1,进一步的qRT-PCR表明AFB1合成相关基因进行qRT-PCR,发现SetB通过黄曲霉素生物合成调控因子和催化酶调控AFB1的合成(图3l)。

此外,作者还将上述菌株感染玉米籽粒,观察孢子、菌丝生长情况,并对AFB1进行测定。总之,这部分的结果表明SetB深度参与该病原菌的发育、真菌毒素代谢和植物内核的定植。


8. SetB的SET结构域与真菌毒力有关

SET结构域是甲基转移酶催化组蛋白赖氨酸甲基化的位点。为了揭示SET结构域在SetB中的作用,将相关真菌菌株点接种于PDA琼脂上。结果表明,setBΔSET的产孢量和菌落直径与ΔsetB相近(图3c-e),这说明它对真菌的分生和菌丝生长具有重要作用。就像在ΔsetB发生的一样,setBΔSET的菌核数量严重减少(图3F)。薄层色谱分析表明,当SET结构域缺失时,仅能检测到微量AFB1(图3j),暗示SetB主要通过其SET结构域调节AFB1的合成。接种setBΔSET菌株的玉米籽粒上菌丝和孢子发育明显少于WT菌株(图3m,n),setBΔSET菌株接种籽粒AFB1含量明显降低(3o,p)。这些结果反映了SET域是SetB的关键元素。


9. SetB和AshA在真菌发育、毒素代谢和毒力方面的协同作用

为了探索SetB和AshA互相作用在真菌毒力中的作用,构建缺失菌株ΔsetB/ashA。与之前的研究策略一致,观察生长表型、菌核情况,TLC分析AFB1的产量,结果显示SetB和AshA的相互作用在AFB1的生物合成中是不可或缺的。

本研究还评估了Set2甲基转移酶家族在黄曲霉毒力中的作用。将上述菌株定植在玉米籽粒上,结果表明:与ΔsetB和setBΔSET菌株相比,被ΔsetB/ashA污染的玉米籽粒表面生长的菌丝和孢子明显减少(图3m,n)。加上之后的TLC分析,结果表明SetB与AshA合作,Set2家族在作物籽粒黄曲霉的真菌毒力和AFB1合成中起关键作用。


10. H3K36的甲基化调节真菌毒素代谢和真菌毒力

为了评估H3K36甲基化对黄曲霉毒力和AFB1产生的影响,将H3K36点突变为H3K36A(H3K36A菌株),结果表明H3K36A菌株与ΔsetB/ashA菌株一样,H3K36的所有甲基化水平都被完全抑制(图3a)。另外,H3K36A菌株的孢子柄稀疏、孢子产量少,菌落直径也与ΔsetB/ashA类似(图3c-e)。结果表明,H3K36的甲基化与真菌分生和菌丝生长的调控密切相关。H3K36A菌株中未发现菌核,推测H3K36的甲基化在菌核形成中起着不可或缺的作用。TLC分析结果则表明在H3K36A菌株中未检测到AFB1,这说明H3K36的甲基化在AFB1生物合成中是必不可少的。最后,作者还评估了H3K36甲基化对真菌毒力的影响。实验结果表明H3K36甲基化与黄曲霉在作物籽粒上的毒力和毒素代谢密切相关。


11. Set2家族调控黄曲霉全基因组H3K36的三甲基化

前面的研究发现H3K36的三甲基化在双缺失菌株中被终止。为了发现H3K36me3调控黄曲霉毒素合成和真菌毒力的机制,以ΔsetB/ashA菌株为对照,用抗H3K36me3单克隆抗体进行ChIP-seq分析,富集WT菌株H3K36me3修饰的染色质片段。富集peaks分布分析表明WT菌株vs ΔsetB/ashA菌株上调富集峰分布在黄曲霉全基因组上。

WT菌株中大部分上调富集峰定位于外显子(46.88%)和启动子(41.25%)区域。ChIP-seq分析中鉴定到5592个peaks,其中有2018个peaks是差异积累的(differently accumulated peaks,DAPs)。这2018个DAPs有1995个DAPs是显著积累在野生型菌株(红色)中,23个DAPs则是积累在ΔsetB/ashA菌株(绿色)中(图4a)。然后,作者做了GO和KEGG富集分析。以上这些结果证实了H3K36me3与该研究揭示的代谢过程、信号转导、生物调控、增殖和生长等各种重要生物过程的调控密切相关。

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图4 由SetB和AshA催化的H3k36me3调控着许多重要的生物过程。

12. AshA和SetB通过H3K36在wetA和steA通路上的三甲基化直接调控真菌繁殖

据报道,丝状真菌的孢子生成过程受到AbaA、AblA和WetA的调控,WetA激活了一系列参与孢子壁不通透性的基因,最终成熟。因此,wetA基因的正常表达是产孢的最后一个调控步骤。ChIP-seq的峰图显示针对wetA基因,H3K36me3修饰的启动子和ORF区域在野生型菌株中富集水平明显高于ΔsetB/ashA菌株(图4d)。qRT-PCR实验展示WT菌株中wetA基因的转录水平高于ΔsetB/ashA菌株(图4e)。

为了明确wetA活性是否受H3K36甲基化调控,ChIP-qPCR基因证明WT菌株中H3K36me3修饰的染色质片段(包括wetA基因启动子和ORF区域)的富集量均极显著高于ΔsetB/ashA菌株(图4f-h)。

转录因子SteA在Aspergillus nidulans有性繁殖中起着不可缺少的作用。黄曲霉的性生殖结构,即带有子囊孢子的子囊鱼,嵌在菌核。根据峰图,与ΔsetB/ashA菌株相比,WT菌株的steA的ORF区明显富集(图4i)。作者随后采用qRT-PCR和ChIP-qPCR验证。以上结果反映Set2家族甲基转移酶通过催化wetA启动子区和ORF染色质区H3K36me3直接促进无性繁殖,通过催化steA ORF染色质区H3K36me3促进有性生殖。


13. H3k36me3修饰aflR染色质区域直接上调AFB1合成代谢

在AFB1合成簇中,AFB1生物合成最重要的调节子是AflR。峰图结果显示在WT菌株中这个调节子启动子和基因编码区域的H3K36me3水平明显高于ΔsetB/ashA菌株的(图5a)。随后的qRT-PCR分析显示,WT菌株的AflR转录水平明显高于ΔsetB/ashA菌株的(图5b)。启动子区域的ChIP-qPCR分析证实与ΔsetB/ashA菌相比,WT菌株aflR启动子片段的H3K36me3修饰明显更多的富集(图5c,d)。进一步的ChIP-qPCR证实,与ΔsetBashA菌株相比,WT的aflR ORF区域在H3K36处发生了显著的三甲基化修饰(图5e)。HPLC实验显示ΔsetB/ashA菌aflR启动子和ORF区域H3K36me3的缺失抑制AFB1和AFB2的产生(图5f),这反映了调控基因H3K36me3水平调节了黄曲霉AFB1的合成。


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图5 SetB和AshA通过催化H3K36的三甲基化来调控AFB1的生物合成。

14. Set2家族甲基转移酶通过底物供应促进真菌毒素合成代谢

乙酰辅酶a是所有已知真菌多酮的基石,由各种生物化学途径产生,包括碳水化合物的糖酵解。淀粉作为一种多糖,是乙酰辅酶a的重要来源。ChIP-seq分析结果显示直链淀粉和蔗糖代谢是KEGG分析中唯一p.adjust<0.5的通路(图4c)。峰图中发现WT菌株碳水化合物代谢途径淀粉酶基因(ALFA_08440)ORF区域的H3K36me3水平显著高于ΔsetB/ashA菌株。

为了检测淀粉酶基因是否受到Set2家族甲基转移酶调控,作者进行了qRT-PCR实验。结果显示,与WT菌株相比,ΔsetB/ashA菌株淀粉酶基因的转录水平明显被抑制(图5h),说明淀粉酶基因受甲基转移酶家族的调控。为了检测直链淀粉是否参与真菌毒素合成代谢,构建了淀粉酶基因缺失株(ΔAFLA_084340)。薄层色谱分析,结果表明淀粉酶的缺失抑制了AFB1的产生。Set2甲基转移酶家族在底物利用水平上通过H3K36三甲基化上调AFB1合成代谢。



研究结果

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图6 AshA和SetB对黄曲霉毒力的调控模型。

作者探索并阐明了黄曲霉中位于细胞核的Set2甲基转移酶家族的生物功能,并确定了由AshA和SetB介导的组蛋白甲基化对真菌毒素合成代谢和真菌对植物和动物毒性的影响。该研究揭示AshA和SetB负责黄曲霉中H3K36甲基化的所有水平,通过它们直接调节致病真菌的真菌毒素合成和真菌毒力。总之,该研究揭示了调控黄曲霉形态发生、真菌毒素合成代谢和真菌毒力属性的潜在表观遗传机制,为开发新的致病真菌预防和控制策略提供了新的视角。


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