发表日期：2022年9月29日
期刊：Journal of Fungi（IF=5.724）
2022年9月29日，海南大学植物保护学院热带植物病虫害绿色防治教育部重点实验室在Journal of Fungi （IF2022=5.724）上在线发表了题为“The T ranscription Factor CsAtf1 Negatively Regulates the Cytochrome P450 Gene CsCyp51G1 to Increase Fludioxonil Sensitivity in Colletotrichum siamense”的研究论文。该研究作者通过ChIP-seq和RNA-seq联合分析获得了转录因子CsAtf1的靶基因CsCyp51G1，通过研究进一步揭示了暹罗炭疽菌对咯菌腈反应的作用机制。爱基百客为该研究提供ChIP-seq、RNA-seq的技术支持。
· 研究背景
咯菌腈被认为是具有代表性的苯吡咯杀菌剂，它的作用模式可能与HOG MAPK途径有关。转录因子Atf1属于ATF/CREB型bZip转录因子家族，在HOG MAPK途径下游起作用，且转录因子CsAtf1参与咯菌腈应激反应，因此进一步研究CsAtf1下游靶基因可能有助于分析咯菌腈敏感性调控机制。此外，据报道据报道，CYP51是许多杀菌剂的靶标，与杀菌剂的耐药性有关。本研究中在先前研究的基础上探究了HOG MAPK CsAtf1是否调节了暹罗炭疽菌对咯菌腈的敏感性。
为了深入了解CsAtf1的调节功能，对野生型和∆CsAtf1突变株进行转录组测序分析，每组3个生物学重复，使用果生炭疽菌基因组作为参考基因组进行后续分析。测序结果显示样本的平均比对率约为73%，大约75% 的reads位于基因外显子区。总的来说，共检测出13214个基因。
∆CsAtf1突变株和WT比对分析发现共有4518个差异基因，其中2354个上调差异基因和2164个下调差异基因。首先对差异基因进行GO富集分析，结果发现上调差异基因在核糖体生物合成、RNA加工和结合功能几个相关的功能显著富集。其中，核糖体生物合成（p值：9.5×10−34）是最显著富集的过程。下调差异基因显著富集的功能与之不同，最显著富集的生物过程与代谢过程有关。此外，对差异基因进行KEGG富集分析，结果表明同一KEGG通路中的基因通常协同发挥生物学功能。在上调差异基因中，有4条KEGG通路显著富集；在下调差异基因中，有13条KEGG通路显著富集，这些生物过程大多与生物合成和代谢有关。
为了研究CsAtf1缺失导致的多效性表型的分子机制，作者进行了ChIP以获得Atf1结合的DNA片段，然后通过下一代测序（ChIP-seq）对其进行分析，共获得30045个peak，平均长度为488 bp。根据Peak在基因功能元件上的分布结果可以看出（图1），48.23%的peak位于基因启动子区，而其他peak结合在基因外显子（35.78%）、内含子（4.93%）和基因间区（11.06%）。ChIP-seq结果共预测出12730个CsAtf1的候选靶基因，通过GO、KEGG富集分析将其分为不同类。使用HOMER进行motif分析，前三个显著富集的基序分别是“CTTCCGTCTACG”、“GTACAGCTTG”和“ATCCGTTCTGAC”（图2）。图1 peak在基因功能元件上的分布
图2 三个显著富集的motif序列
三、RNA-seq和ChIP-seq联合分析表明一些细胞色素氧化酶基因是候选的CsAtf1靶基因
根据RNA-seq和ChIP-seq的数据预测到共有3809个显著差异基因被CsAtf1直接调控（图3），其中2029个和1780个基因在∆CsAtf1突变体，这些基因与5922个peak相关。它们主要位于外显子（约49%）区和基因上游区域（约44%），这表明CsAtf1通过结合外显子和启动子区域直接靶向和调节基因。值得注意的是，预测结果中有24个细胞色素氧化酶基因被CsAtf1直接靶向。
图3 ∆CsAtf1突变体中与CsAtf1直接结合的差异基因的韦恩图
四、CsAtf1作为上游调节因子负调控CsCyp51G1的表达
甾醇14-α去甲基酶（CYP51）是CYP基因超家族中分布最广泛的成员，是治疗微生物致病性感染的药物靶点。在本研究中，作者观察到CYP51编码基因（CYP51G1，基因ID:43616755）是CsAtf1的候选靶基因。因此，首先确认了CYP51G1基因与CsAtf1之间的关系。序列分析表明，其DNA大小为1712 bp，cDNA大小为1548 bp，编码514个氨基酸，具有保守的P450结构域（图4）。
图4 CsCyp51G1的蛋白质结构域和系统发育分析ChIP-seq数据显示，转录因子CsAtf1与CsCyp51G1的启动子区(peak_16380)结合。作者扩增了CsCyp51G1启动子区含有peak_16380的273 bp DNA片段进行EMSA实验，结果表明CsCyp51G1启动子和CsAtf1蛋白形成稳定的蛋白质-DNA复合物，如实验组（泳道2）中存在的慢滞带所示，但在对照组和冷竞争探针组（泳道1/3）中不存在。此外，作者构建pGADT7-CsAtf1和具有1500 bp CsCyp51G1启动子的pHis2-P-CsCyp51G1载体进行Y1H实验，结果显示所有酵母菌落在不含3-AT的培养基（SD/-Leu/-Trp/-His）上均生长良好，在含有80 mM 3-AT的培养基上，只有实验组和阳性对照正常生长。因此，通过ChIP-seq、EMSA 和 Y1H 验证，证实了转录因子CsAtf1与CsCyp51G1启动子存在相互作用（图5）。RNA-Seq数据显示，与WT相比，ΔCsAtf1突变体中的CsCyp51G1基因上调表达。作者利用qRT-PCR测定了ΔCsAtf1突变体、ΔCsPbs2突变体和WT菌株HN08中CsAtf1和CsCyp51G1的表达量，结果表明ΔCsAtf1和ΔCsPbs2突变体中CsCyp51G1的转录水平显著上调。因此，qRT-PCR结果进一步证实了RNA-Seq分析的结果。综上所述，转录因子CsAtf1和上游基因CsPbs2负调控CsCyp51G1的表达。
图5 CsAtf1与CsCyp51G1结合和表达关系分析
五、CsCyp51G1参与暹罗炭疽菌对咯菌腈的敏感性调节
前期研究表明，CsAtf1转录因子参与了暹罗炭疽菌对咯菌腈敏感性调控。由于CsCyp51G1是CsAtf1的靶基因，作者进一步研究了CsCyp51G1是否参与了这一过程。首先作者构建了一个∆CsCyp51G1突变体，用ILV1基因的2817 bp片段取代了CsCyp51G1基因1712 bp的开放阅读框。Southern blot验证了ΔCsCyp51G1突变体仅含有ILV1基因的一个拷贝。随后作者构建了pXY203-RP27-Cyp51G1过表达载体，转化后获得了CsCyp51G1-OE菌株，并用qRT-PCR验证了CsCyp51G1-OE菌株中CsCyp51G的表达量显著高于WT（图6）。图6 验证基因缺失突变体ΔCsCyp51G1和过表达菌株CsCyp51G1-OE
观察WT、ΔCsCyp51G1突变体、CsCyp51G1-OE菌株、ΔCsAtf1突变体和ΔCsPbs2突变体在CM平板上的菌丝生长情况，发现CM的菌落形态和分生孢子大小无显著差异。然而，在咯菌腈胁迫条件下，CsCyp51G1-OE菌株的菌丝体生长速率显著高于WT，而ΔCsCyp51G1突变株的菌落大小显著降低（图7）。这一结果表明，CsCyp51G1基因的过表达可增加咯菌腈的耐药性，而CsCyp51G1不表达可增加咯菌腈的敏感性。这些结果表明，CsCyp51G1基因参与咯菌腈敏感性调控，即转录因子CsAtf1负调控CsCyp51G1基因，导致咯菌腈耐受性增加。图7 WT菌株HN08、ΔCsPbs2、ΔCsAtf1、CsCyp51G1-OE和ΔCsCyp51G1的咯菌腈耐药性比较
六、CsCyp51G1调节咯菌腈敏感性，但不影响暹罗炭疽菌中麦角甾醇含量
CYP51是参与真菌麦角甾醇生物合成的关键酶，作者试图通过改变麦角甾醇水平来确定CsCyp51G1是否影响咯菌腈敏感性。采用HPLC法测定了WT、ΔCsCyp51G1突变体、CsCyp51G1-OE、ΔCsAtf1突变体和ΔCsPbs2突变体的麦角甾醇含量（图8），结果表明ΔCsPbs2突变体、ΔCsAtf1突变体、CsCyp51G1-OE和ΔCsCyp51G1突变体菌株的麦角甾醇水平均显著高于WT。因此作者推测CsCyp51G1通过影响暹罗炭疽菌中麦角甾醇含量以外的因素来调节咯菌腈敏感性。
图8 WT HN08、ΔCsPbs2、ΔCsAtf1、CsCyp51G1-OE 和 Δ CsCyp51G1 中的麦角甾醇含量
在本研究中，作者提出了一种新的模型（图9），即CsAtf1调节CsCyp51G1表达，导致咯菌腈敏感性。本研究不仅丰富了对HOG MAPK-CsAtf1机制的认识，而且进一步揭示了咯菌腈的生物学机制。
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提取码：c3en
将染色质免疫共沉淀与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。
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