项目文章 | New Phytol & Small RNA-seq和ChIP-seq联合分析助力揭示稻曲菌抑制水稻免疫的新机制

期刊：New Phytologist

影响因子：10.323

发表日期：2022.5.20

单位：华中农业大学农业

2022年5月20日华中农业大学植物科学技术学院黄俊斌教授课题组在期刊New Phytologist上发表一篇名为“A secreted fungal effector suppresses rice immunity through host histone hypoacetylation”的研究论文。作者利用Small RNA-seq、ChIP-seq、Y2H 、Western blotting、Co-IP和BiFC技术，从表观遗传水平揭示了稻曲菌利用效应蛋白操纵水稻组蛋白去乙酰化抑制寄主免疫的新机制。爱基百客为该研究提供Small RNA-seq和ChIP-seq的技术支持。

稻曲病是水稻生产中的重要病害之一，广泛分布于亚洲、美洲、非洲、欧洲等四十多个水稻种植国家。在我国，稻曲病发生尤为严重，年均发生面积4500万亩、减产1.5亿公斤以上。稻曲病不仅造成稻米产量损失，更为重要的是稻曲球中产生的毒素对动物细胞具有毒性和致畸作用，严重威胁粮食安全。培育和利用抗病品种是作物病害防控、维持农业绿色持续发展最经济、有效的手段，但现阶段抗稻曲病品种和基因资源严重缺乏，还未发现可利用的天然抗原。因此，深入解析稻曲菌侵染机制及其与水稻的互作机理，可为水稻抗稻曲病品种的分子育种改良提供理论依据和重要资源。

植物与病原菌互作过程中，植物本身进化出一套有效的先天免疫系统来抵御病原菌的侵染，主要包括PTI（PAMP-triggered immunity）和ETI（Effector-triggered immunity）两个免疫层次。病原菌为了成功侵染植物会分泌大量效应蛋白来抑制植物的免疫反应，发挥毒性功能。前人研究表明，组蛋白乙酰化是调节植物免疫的一种重要表观遗传修饰，但病原真菌是否进化出直接靶向植物组蛋白乙酰化的效应蛋白尚不清楚。

1.UvSec117是U.virens致病的关键效应因子

作者为了确定U.virens分泌蛋白在感染过程中的潜在作用，首先联合分析稻曲菌分泌组和转录组数据，选取19个候选分泌蛋白进行基因敲除，接种发现分泌蛋白UvSec117的基因敲除突变体致病力显著减弱，qRT-PCR和表型观察分析说明UvSec117是致病所必需的。

通过酵母分泌系统证明其信号肽具有分泌活性，信号肽缺失导致突变体致病力降低。接着利用亚细胞定位检测UvSec117在植物中双重定位于细胞核和细胞质。作者测试了表达UvSec117对小鼠促凋亡蛋白Bax诱导程序性细胞死亡（PCD）的影响，进而确定UvSec117可能通过干扰植物免疫应答来抑制Bax诱导PCD。最后，作者通过酵母杂交系统发现UvSec117在酵母中具有自结合作用（图1）。以上结果说明UvSec117是U.virens致病的关键效应因子。

2. UvSec117与水稻组蛋白脱乙酰酶OsHDA701相互作用

作者为了进一步验证UvSec117在植物感染期间的功能，通过酵母双杂交库筛选到互作蛋白水稻组蛋白去乙酰化酶OsHDA701，然后采用Y2H、GST pull-down、Co-IP以及BiFC技术（图2），证明了UvSec117与OsHDA701在细胞核和细胞质中互作。

3.OsHDA701负调节水稻对病原菌的广谱抗性

作者为明确OsHDA701在水稻中的抗感功能，在水稻中沉默OsHDA701基因（图3a，b），通过表型观察及生理指标测定和qRT-PCR发现OsHDA701-RNAi 转基因水稻对稻曲病、稻瘟病和水稻白叶枯病（图3c-f）的抗性增强，说明OsHDA701负调控水稻的广谱抗病性。

图3.OsHDA701的沉默增强了水稻对水稻病原体的抗性

4.UvSec117促进OsHDA701核定位和脱乙酰活性

作者进一步将UvSec117和OsHDA701进行共表达，通过荧光观察和Western blot证明OsHDA701在细胞核中含量明显增加（图4），说明UvSec117可招募更多的OsHDA701蛋白进入细胞核。

图4.UvSec117调节OsHDA701的核定位和组蛋白脱乙酰活性

5.UvSec117通过调节H3K9ac标记的基因抑制水稻免疫

作者然后通过一系列体内、体外生化试验，证明OsHDA701主要清除组蛋白H3K9乙酰化修饰，而UvSec117增强了OsHDA701的去乙酰化活性。在水稻中异源超表达UvSec117，35S-UvSec117转基因水稻对稻曲病、稻瘟病和白叶枯病更为感病，且转基因水稻中H3K9乙酰化修饰水平显著降低，表明UvSec117干扰了水稻H3K9乙酰化修饰。ChIP-seq鉴定发现35S-UvSec117转基因水稻中H3K9乙酰化修饰调控的靶基因数量显著减少，qRT-PCR和ChIP-PCR证明35S-UvSec117转基因水稻中H3K9乙酰化修饰调控的抗病相关基因表达量显著降低（图5），说明UvSec117通过影响水稻组蛋白H3K9乙酰化修饰干扰抗病基因表达。

6.沉默U.virens中的UvSec117基因增强水稻对RFS的抗性

作者在水稻中沉默UvSec117基因，通过扫描电子显微镜观察、qRT-PCR、小RNA测序以及荧光原位杂交（FISH）测定分析发现，沉默U.virens中的UvSec117基因可以增强水稻对RFS的抗性，说明在转基因水稻植株中沉默UvSec117可以促进对U.virens的抗性。

综上，稻曲菌可分泌一种毒性效应蛋白UvSec117进入寄主细胞中，与水稻组蛋白去乙酰化酶OsHDA701靶向互作，通过UvSec117的核定位信号将大量的OsHDA701招募到细胞核，同时UvSec117与OsHDA701互作过程中可增强OsHDA701去乙酰化活性，从两方面降低水稻组蛋白H3K9乙酰化水平，进而干扰防御基因的激活和寄主免疫（图7）。这是第一个直接证据证实植物病原真菌效应蛋白靶向寄主组蛋白去乙酰化酶抑制植物免疫；在表观遗传水平揭示了稻曲菌乃至植物病原真菌中一种新的致病策略，拓宽了我们对病原菌抑制寄主免疫途径的认识。研究中获得的水稻广谱抗病性负调控因子OsHDA701，对于水稻抗病育种和分子育种改良具有重要的科学价值。