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项目文章 | IF>7中国科学院动物研究所发表“埃及伊蚊”蜕化素信号在生殖和免疫平衡中的机制

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发表单位:中国科学院动物研究所

发表日期:2022年9月22日

发表期刊:PLOS PATHOGENS

研究技术:RNA-seq、ChIP-qPCR、EMSA(爱基百客均可提供


2022年9月22日,中国科学院动物研究所邹振课题组在著名期刊PLOS PATHOGENS (IF:7.464) 发表题为“Ecdysone signaling mediates the trade-off between immunity and reproduction via suppression of amyloids in the mosquito Aedes aegypti”的研究论文。该研究揭示了20E信号在维持埃及伊蚊生殖和免疫平衡中的关键作用。爱基百客为该研究提供RNA-seq的技术支持

研 究 背 景


吸血雌蚊利用脊椎动物的血液作为它们产卵的营养和能量来源。为了繁殖后代,雌蚊需要反复吸血,这使得它们成为许多严重疾病传播的关键媒介。在吸血蚊中,促性腺周期主要包括羽化后阶段(PE)和吸血后阶段(PBM),分别受保幼激素(JH)和20-羟基蜕皮酮(20E)两种昆虫激素的调节。JH调控卵黄发生的前期事件,而20E是调节卵黄发生、卵子成熟和排卵的主要激素。20E可以结合在蜕皮素受体(EcR)和超气门蛋白(USP)的异二聚体受体复合物上,启动转录级联反应,负责卵黄原素(Vg)基因的表达。Vg蛋白从脂肪体中分泌,随后被卵母细胞吸收,促进卵子成熟。脂肪组织是卵黄发生和免疫防御的中心部位。果蝇受到细菌感染或者免疫通路激活后,其繁殖能力会下降。在疟蚊出现败血症的时候,其卵泡细胞凋亡发生,导致产卵减少。相反,生殖能力的增加会导致雌性昆虫的免疫能力下降。在埃及伊蚊PE阶段,JH可以下调免疫相关基因(IMRGs)表达。然而,20E在维持埃及伊蚊生殖、免疫平衡中的作用仍然不清楚为了探讨20E与IMD通路之间的相互作用,作者采用一系列实验证实了20E对IMD通路的调控作用,以及在维持生殖和免疫平衡中的影响。

研 究 材 料

埃及伊蚊、阴沟肠杆菌(E. cloacae)、Aag2细胞系。

研 究 思 路

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研 究 结 果

1. 蜕化素信号在PBM繁殖阶段下调IMP通路
为了探讨20E与IMD通路之间的相互作用,作者在蚊子PE 2d注射EcR dsRNA (iEcR)来阻碍20E信号通路并且在PBM 12h后感染E. cloacae。免疫荧光染色试验显示,与iEGFP_PBS雌蚊相比iEcR_PBS蚊子肽聚糖识别蛋白(PGRP-LC)水平明显升高,并且iEcR蚊子在E. cloacae感染之后,PGRP-LC存在较高的表达水平(图1A和1C)。
接下来,作者分析了在PBM阶段EcR对蚊虫同源基因Rel2表达的影响。免疫荧光显示PBS处理过的iEcR蚊子在感染E. cloacae 12 h后脂肪体中Rel2丰度较高(图1B、1D)。此外,感染E. cloacae后iEcR蚊的存活率显著高于iEGFP_Ec蚊(图2A)。这些数据有力地表明20E和EcR负向调节蚊子的免疫反应。
为了进一步了解20E信号对IMRGs表达的影响,作者对吸血后的iEcR蚊子脂肪体进行RNA-Seq测序。结果显示在iEcR_Ec蚊体内有一组IMRGs的表达量显著高于iEGFP_Ec蚊(图2B)。作者将三个处理样本(iEcR_Ec、iEcR_PBS和iEGFP_Ec) 与未感染的对照样本(iEGFP_PBS)进行比较分析共有的和唯一的差异表达的IMRGs(图2C)。相对于iEGFP_PBS对照组而言,其中58个基因在iEcR_Ec蚊体内高度激活,而在iEGFP_Ec蚊体内仅中度激活。这些高度激活基因中大多数被鉴定为IMD途径、抗菌肽 (AMPs) 、黑化作用和Toll途径的组成部分(图2D)。
在iEcR_PBS脂肪体中也观察到Dpt、c型凝集素(CTLMA12和CTLMA15)和多种剪接结构域丝氨酸蛋白酶的转录(图2D),这表明20E信号在自然条件下下调了先天免疫主要成分的表达。


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图1 RNAi沉默EcR导致PGRP-LC和Rel2在细菌感染反应中激活升高


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图2 沉默EcR增加感染易感性和诱导IMRG表达


2. 在PBM繁殖期Pirk-like对20E的响应

为了识别IMD通路响应20E信号的潜在因素,作者检测了PBM期的9个时间点(3-72小时)IMD通路相关基因的整体表达。结果显示PGRP-LCIMDBenIAP2Rel2表达上调与20E滴度呈正相关(图3A)。然而,作者发现PGRP-LC的蛋白水平与PBM期是一致的,在PBM 24 - 60 h细胞核中几乎检测不到Rel2(图3B)。

Jaspar程序分析显示,Pirk -likeDNR1STAT92ECaspar启动子区包含高度保守的EcRE(图3C),而在未感染的iEcR蚊子中,只有Pirk -like基因显著降低(图3D、3E)。此外,脓毒性损伤后iEcR蚊的Pirk -like增加,但低于感染的iEGFP蚊,提示在PBM期,Pirk -like可能由20E和免疫刺激共同调节。此外,在EcR和USP-过表达的埃及伊蚊(Aag2)细胞中,Pirk –like可以被20E诱导(图3F)。Pirk –like表达的时间历程表明,在整个PE期,Pirk –like表达非常低,但在PBM阶段显著增加,其表达峰与EcR一致(图3G)。在PBM期,Pirk -like似乎受到20E的调控,以抑制IMD通路。

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图3 Pirk-like 表达受20E信号调控


3.20E-EcR-USP复合体结合Pirk-like基因的调控区域


作者发现在Pirk -like基因调控区中-1590 bp和-818 bp发现了两个保守的EcRE基序,即EcRE1和EcRE2(图3C、4A)。为了评估Pirk -like基因启动子区域与EcR结合的相互作用,作者进行了ChIP-qPCR实验。在EcR-和USP共表达的细胞中,ChIP-qPCR结果显示在Pirk -like的EcRE2上存在富集(图4B)。
随后,作者通过电泳凝胶迁移试验(EMSA)来分析EcR-USP和Pirk -like之间的相互作用。使用EcR和USP过表达Aag2细胞的核蛋白提取物,EMSA结果显示EcR可以与EcRE2探针结合,EcRE2突变探针可以竞争性降低V5-EcR-USP复合体与特定带生物素标记Pirk -like探针的强度(图4C)。这验证了Pirk -like的EcRE2功能,证实了EcR-USP与Pirk -like启动子在体外直接结合。
此外,作者采用双荧光素酶报告试验在体内研究EcR-USP和Pirk –like启动子之间的相互作用。在20E处理之后,共同表达V5-EcR和HA-USP会诱导 Pirk -like荧光素酶报告蛋白水平增加5.6倍(图4D),显示EcR和USP能够以剂量依赖性的方式诱导Pirk -like表达。这些数据表明20E-EcR-USP异源二聚体直接与Pirk -like的EcRE2结合,介导其在20E存在下表达。


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图4 20E-EcR-USP可以直接结合Pirk-like的EcRE基序


4. Pirk –like与淀粉样蛋白的形成相互作用并破坏其形成

哺乳动物RHIMs的核心基序IQIG或VQVG折叠成交叉β片构象,形成功能性淀粉样原纤维,这与坏死信号转导有关。在果蝇中,PGRP-LC、PGRP-LE和IMD的cRHIM可形成淀粉样原纤维。作者发现埃及伊蚊PGRP-LE和IMD具有VHIG基序,果蝇中PGRP-LC的cRHIMs与哺乳动物的RHIMs高度保守,第三位(P3) V被N取代。这种序列相似性显示在埃及伊蚊中可以形成淀粉样聚集体。因此,作者使用硫磺素T(ThT) 荧光检测Aag2细胞中的淀粉样蛋白。过表达V5标记PGRP-LC, PGRP-LE或IMD的细胞中存在较强的ThT荧光信号(图5A)。结果表明尽管其序列是可变的,埃及伊蚊cRHIM可以形成淀粉样原纤维。此外,pull-down实验在体外鉴定了His -标记的Pirk –like(His-Pirk-like)与PGRP-LC、PGRP-LE以及IMD的互作(图5B)。

然后,作者为了确定Pirk –like是否可以通过阻断淀粉样蛋白的形成来影响IMD信号。将V5-标记 Pirk-like与HA-标记PGRP-LC、PGRP-LE或IMD共转染到Aag2细胞中。HA抗体染色检测PGRP-LC、PGRP-LE和IMD在空载和Pirk-like共转染细胞中的表达相似。然而,ThT信号在Pirk-like共表达细胞中极其微弱(图5C-5E),表明Pirk-like终止了Aag2细胞中淀粉样蛋白的形成。总的来说,Pirk-like与PGRP-LC、PGRP-LE和IMD相互作用并抑制淀粉样蛋白的形成。

作者为了检测在PBM 24小时EcR沉默对脂肪体中cRHIMs介导的淀粉样蛋白形成的影响。作者在iEcR蚊PBM 12h后注射ThT,然后感染E. cloacae。结果显示在注射ThT后,在感染E. cloacae的iEcR蚊中除了CecB之外,Rel2Dpt和 DefC表达明显降低(图5F)。这些数据再次证实了20E通过调节淀粉样蛋白的形成来抑制IMD通路,并表明ThT特异性地抑制了IMD通路。

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图5 Pirk-like通过PGRP-LC、PGRP-LE、 和IMD干扰淀粉样聚集物的形成


5. Pirk-like缺陷型蚊子表现出超免疫反应和较强的细菌抗性


为了更好地表征Pirk-like蚊子的生理功能,作者使用CRISPR-Cas9获得了Pirk-like缺陷蚊子(Pirk-like-/-)。在PBS处理过的Pirk-like-/-蚊子(Pirk-like-/-_PBS)中PGRP-LC和Rel2丰度很高,与受感染的野生型(WT_Ec)蚊子相似(图6A-6C),这表明Pirk-like敲除可以在吸血后充分激活IMD通路。与WT_Ec蚊子或正常对照相比,感染E. cloacae的Pirk-like-/-蚊子(Pirk-like-/-_Ec)具有更高的抗菌反应,其特征是在脂肪体中一组C型凝集素、丝氨酸蛋白酶和AMPs的转录水平升高(图6D)。在未感染的Pirk-like-/-蚊子中,DefDDefCDefERel2CTLGA5FREP18被强烈诱导(图6D)。在Pirk-like-/-_PBS蚊子中免疫反应蛋白的过度激活意味着野生型蚊子吸血后诱导了Pirk-like大量表达,抑制先天免疫激活。Pirk-like-/-蚊子在脓毒性损伤后存活率明显上升,当注射ThT后可以恢复(图6E、6F)。这表明ThT有效地终止了IMD通路的激活,并恢复了Pirk-like-/-蚊子表型。


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图6 Pirk-like 作为IMD通路的重要负调控因子


6. IMD通路的激活会损害生殖


昆虫对微生物的免疫系统的过度激活,可以通过减少卵细胞中营养蛋白的积累,导致卵泡细胞凋亡和卵产量下降,从而对雌性生殖产生负面影响。在PBM阶段,Pirk-like-/-蚊子中IMD通路会被激活(图6A)。作者通过对Pirk-like-/-蚊子和野生型蚊子卵巢发育进行分析,发现Pirk-like-/-雌性蚊子的卵巢不能完全成熟(图7A)。荧光染色显示,在PBM 24 h时, Vg在WT雌性脂肪体中强烈表达。相比之下,E. cloacae处理后显著降低了WT蚊子的Vg水平,表明免疫激活损害了Vg的表达。在Pirk-like-/-和Pirk-like+/-蚊子中也发现类似现象。这可能是IMD通路激活的原因,特别是在脓毒性损伤后(图7B、7C)。Pirk-like-/-雌性蚊子比WT_PBS雌性产卵少,但是与WT_Ec蚊子相似(图7D)。它们的产卵量的差异可能是由于不同的血液摄入量所致。因此,作者测量了雌性在采血前后的体重,并计算了它们的血液摄入量。结果表明,Pirk-like-/-和野生蚊子的血液摄入量相似(图7E)。这些数据表明,IMD通路的激活会损害埃及伊蚊的繁殖能力。


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图7 敲除Pirk-like会损害蚊子的繁殖力


研 究 结 论

免疫和生殖之间的平衡对于许多关键的生理功能至关重要。本研究揭示了20E和EcR在埃及伊蚊生殖周期的PBM阶段下调IMD通路。RNA介导的EcR缺失诱导IMD通路成员的表达增加,这些蚊子对革兰氏阴性菌感染更有抵抗力。此外,20E和EcR招募了Pirk-like即黑腹果蝇的同源物。CRISPR-Cas9敲除Pirk-like已经表明,Pirk-like通过干扰IMD介导的淀粉样蛋白聚集物的形成来抑制IMD通路。20E和EcR破坏淀粉样蛋白的形成是维持正常的卵黄蛋白生产和生育能力的关键。此外,20E及其受体EcR直接诱导Pirk-like干扰淀粉样蛋白的形成。本研究主要强调了20E在控制免疫和繁殖之间平衡的重要作用。Pirk-like可能是控制蚊子繁殖和病原体传播的潜在新靶点。


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