项目文章 | IF>7中国科学院动物研究所发表“埃及伊蚊”蜕化素信号在生殖和免疫平衡中的机制

发表单位：中国科学院动物研究所

发表日期：2022年9月22日

发表期刊：PLOS PATHOGENS

研究技术：RNA-seq、ChIP-qPCR、EMSA（爱基百客均可提供）

2022年9月22日，中国科学院动物研究所邹振课题组在著名期刊PLOS PATHOGENS (IF：7.464) 发表题为“Ecdysone signaling mediates the trade-off between immunity and reproduction via suppression of amyloids in the mosquito Aedes aegypti”的研究论文。该研究揭示了20E信号在维持埃及伊蚊生殖和免疫平衡中的关键作用。爱基百客为该研究提供RNA-seq的技术支持。

吸血雌蚊利用脊椎动物的血液作为它们产卵的营养和能量来源。为了繁殖后代，雌蚊需要反复吸血，这使得它们成为许多严重疾病传播的关键媒介。在吸血蚊中，促性腺周期主要包括羽化后阶段(PE)和吸血后阶段(PBM)，分别受保幼激素(JH)和20-羟基蜕皮酮(20E)两种昆虫激素的调节。JH调控卵黄发生的前期事件，而20E是调节卵黄发生、卵子成熟和排卵的主要激素。20E可以结合在蜕皮素受体(EcR)和超气门蛋白(USP)的异二聚体受体复合物上，启动转录级联反应，负责卵黄原素(Vg)基因的表达。Vg蛋白从脂肪体中分泌，随后被卵母细胞吸收，促进卵子成熟。脂肪组织是卵黄发生和免疫防御的中心部位。果蝇受到细菌感染或者免疫通路激活后，其繁殖能力会下降。在疟蚊出现败血症的时候，其卵泡细胞凋亡发生，导致产卵减少。相反，生殖能力的增加会导致雌性昆虫的免疫能力下降。在埃及伊蚊PE阶段，JH可以下调免疫相关基因（IMRGs）表达。然而，20E在维持埃及伊蚊生殖、免疫平衡中的作用仍然不清楚。为了探讨20E与IMD通路之间的相互作用，作者采用一系列实验证实了20E对IMD通路的调控作用，以及在维持生殖和免疫平衡中的影响。

埃及伊蚊、阴沟肠杆菌（E. cloacae）、Aag2细胞系。

2. 在PBM繁殖期Pirk-like对20E的响应

为了识别IMD通路响应20E信号的潜在因素，作者检测了PBM期的9个时间点(3-72小时)IMD通路相关基因的整体表达。结果显示PGRP-LC、IMD、Ben、IAP2和Rel2表达上调与20E滴度呈正相关（图3A）。然而，作者发现PGRP-LC的蛋白水平与PBM期是一致的，在PBM 24 - 60 h细胞核中几乎检测不到Rel2（图3B）。

Jaspar程序分析显示，Pirk -like、DNR1、STAT92E和Caspar启动子区包含高度保守的EcRE（图3C），而在未感染的iEcR蚊子中，只有Pirk -like基因显著降低（图3D、3E）。此外，脓毒性损伤后iEcR蚊的Pirk -like增加，但低于感染的iEGFP蚊，提示在PBM期，Pirk -like可能由20E和免疫刺激共同调节。此外，在EcR和USP-过表达的埃及伊蚊(Aag2)细胞中，Pirk –like可以被20E诱导（图3F）。Pirk –like表达的时间历程表明，在整个PE期，Pirk –like表达非常低，但在PBM阶段显著增加，其表达峰与EcR一致（图3G）。在PBM期，Pirk -like似乎受到20E的调控，以抑制IMD通路。

3.20E-EcR-USP复合体结合Pirk-like基因的调控区域

4. Pirk –like与淀粉样蛋白的形成相互作用并破坏其形成

哺乳动物RHIMs的核心基序IQIG或VQVG折叠成交叉β片构象，形成功能性淀粉样原纤维，这与坏死信号转导有关。在果蝇中，PGRP-LC、PGRP-LE和IMD的cRHIM可形成淀粉样原纤维。作者发现埃及伊蚊PGRP-LE和IMD具有VHIG基序，果蝇中PGRP-LC的cRHIMs与哺乳动物的RHIMs高度保守，第三位(P3) V被N取代。这种序列相似性显示在埃及伊蚊中可以形成淀粉样聚集体。因此，作者使用硫磺素T(ThT) 荧光检测Aag2细胞中的淀粉样蛋白。过表达V5标记PGRP-LC, PGRP-LE或IMD的细胞中存在较强的ThT荧光信号（图5A）。结果表明尽管其序列是可变的，埃及伊蚊cRHIM可以形成淀粉样原纤维。此外，pull-down实验在体外鉴定了His -标记的Pirk –like(His-Pirk-like)与PGRP-LC、PGRP-LE以及IMD的互作（图5B）。

然后，作者为了确定Pirk –like是否可以通过阻断淀粉样蛋白的形成来影响IMD信号。将V5-标记 Pirk-like与HA-标记PGRP-LC、PGRP-LE或IMD共转染到Aag2细胞中。HA抗体染色检测PGRP-LC、PGRP-LE和IMD在空载和Pirk-like共转染细胞中的表达相似。然而，ThT信号在Pirk-like共表达细胞中极其微弱（图5C-5E），表明Pirk-like终止了Aag2细胞中淀粉样蛋白的形成。总的来说，Pirk-like与PGRP-LC、PGRP-LE和IMD相互作用并抑制淀粉样蛋白的形成。

作者为了检测在PBM 24小时EcR沉默对脂肪体中cRHIMs介导的淀粉样蛋白形成的影响。作者在iEcR蚊PBM 12h后注射ThT，然后感染E. cloacae。结果显示在注射ThT后，在感染E. cloacae的iEcR蚊中除了CecB之外，Rel2、Dpt和 DefC表达明显降低（图5F）。这些数据再次证实了20E通过调节淀粉样蛋白的形成来抑制IMD通路，并表明ThT特异性地抑制了IMD通路。

5. Pirk-like缺陷型蚊子表现出超免疫反应和较强的细菌抗性

6. IMD通路的激活会损害生殖

免疫和生殖之间的平衡对于许多关键的生理功能至关重要。本研究揭示了20E和EcR在埃及伊蚊生殖周期的PBM阶段下调IMD通路。RNA介导的EcR缺失诱导IMD通路成员的表达增加，这些蚊子对革兰氏阴性菌感染更有抵抗力。此外，20E和EcR招募了Pirk-like即黑腹果蝇的同源物。CRISPR-Cas9敲除Pirk-like已经表明，Pirk-like通过干扰IMD介导的淀粉样蛋白聚集物的形成来抑制IMD通路。20E和EcR破坏淀粉样蛋白的形成是维持正常的卵黄蛋白生产和生育能力的关键。此外，20E及其受体EcR直接诱导Pirk-like干扰淀粉样蛋白的形成。本研究主要强调了20E在控制免疫和繁殖之间平衡的重要作用。Pirk-like可能是控制蚊子繁殖和病原体传播的潜在新靶点。