项目文章 | ChIP-seq再立功，爱基百客助力南开大学程志晖团队发表病原微生物CtrA的调控机制

客户单位：南开大学

期刊：Frontiers in Cellular and Infection Microbiology（IF：6.073）

核心干实验：ChIP-seq（爱基百客提供）

01  技术背景

Ehrlichia chaffeensis（查菲埃立克体）是一种革兰氏阴性的强制性细胞内细菌，优先感染人类单核细胞或巨噬细胞，并引起人类单核细胞埃利希体病（HME）。HME是一种最流行的、威胁生命的新发人畜共患病，临床症状为头痛、发烧、肌痛、乏力伴贫血、白细胞减少、血小板减少和转氨酶升高。近40-60%的患者需要住院治疗，死亡率约为3%。

CtrA是双组分调控系统CckA/CtrA的一种反应调节因子，在变形菌门Anplasmataceae（无形小体科）家族的所有测序成员中保守。CtrA保守结合基序是TTAA-N7-TTAAC （9-mer）和TTAACCAT（8-mer）。在E.chaffeensis中，CtrA与bolA、surE、ompA、gshA和gshB的启动子区域结合并激活其表达，所有这5个基因都是E.chaffeensis感染和生存的关键。但这种调控机制在同家族其他成员如C.crescentus中不存在，表明E.chaffeensis具有独特的CtrA调控机制，并导致对其专性细胞内生长的适应。然而，E.chaffeensis中的CtrA调控机制尚未完全阐明。

在宿主经受感染后，免疫细胞能够通过产生活性氧（ROS）来杀死病原体。前人发现E.chaffeensis EtpE能够阻断ROS的生成，Etf-1上调宿主锰超氧化物歧化酶（MnSOD）以降低巨噬细胞中的ROS水平，但不能抑制中性粒细胞产生ROS，其响应其他细胞ROS的机制在很大程度上仍然未知。

GshA和GshB是两种酶，催化L-谷氨酸（L-Glu）、L-半胱氨酸（L-Cys）和L-甘氨酸（L-Gly）合成最有效的天然抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）。在E.chaffeensis中，作者发现氧化应激时CtrA激活了GshA和GshB的表达。在细菌中，谷胱甘肽可被谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和谷胱甘肽s-转移酶（gst）利用来消除ROS。然而，E.chaffeensis缺乏GPx，并且只编码一个GST（ECH_0847）。E.chaffeensis gst的功能和调控仍有待进一步研究。在本研究中，为了深入了解CtrA在E.chaffeensis中的调控，作者进行了ChIP-seq，并确定了包括gst在内的211个基因受CtrA调控。随后通过体外酶学分析和体内敲除肽核酸（PNA），验证了gst的功能。

02  技术线路

03  研究结果

为了鉴定E.chaffeensis中CtrA调控的基因，作者首先进行了ChIP-seq实验。发现211个基因的启动子区域富集。COG分析显示，这些基因参与辅酶转运代谢、能量产生和转化、复制、重组和修复等多种功能（图1）。与前期研究一致，gst、ctrA、bolA、surE、gshB、gshA和ompA启动子区也被富集。

在这些富集的基因中，GST是一种酶，能够催化GSH与ROS的反应，然后消除ROS。作者使用pDRAW32 DNA分析软件（http://acaclone.com/）在gst启动子区域发现了一个9-mer CtrA结合基序（TTAA-N₇-TTAAC）。这些结果表明，CtrA可调控E.chaffeensis中gst的表达。

为了确认gst的表达是否受到CtrA的调控，作者利用qRT-PCR检测了同步培养的E.chaffeensis在THP-1细胞中的gst表达模式。CtrA在E.chaffeensis细胞内生长后期表达，而同时，在E.chaffeensis细胞内生长后期，gst的表达也上调（图2A），说明gst的表达可能受到CtrA的调控。

GshA和GshB分别是谷氨酸-半胱氨酸连接酶和谷胱甘肽合成酶，催化从L-Glu，L-Gly，L-Cys和ATP合成GSH。此前发现CtrA在氧化应激时激活E.chaffeensis中GshA和GshB的表达。然后作者研究了氧化应激时CtrA是否激活了gst的表达。PNA是一种DNA模拟物，能以高亲和力和特异性结合单链和双链DNA和RNA，并可用于降低E.chaffeensis蛋白水平。用CtrA PNA（蛋白表达会被敲低）或CTL PNA（对照）转染无宿主细胞的E.chaffeensis，随后感染THP-1细胞并用H₂O₂处理。作者发现，经H₂O₂处理后，转染CTL PNA的E.chaffeensis中gst的表达显著上调，而CtrA PNA的gst表达无明显变化（图2B）。这表明gst可能是赋予E.chaffeensis抗氧化应激能力所必需的，且其受到CtrA的调控。然后作者使用GST-rCtrA进行EMSA，结果表明CtrA直接与E.chaffeensis的gst启动子结合（图2C）。

由于在E.chaffeensis中缺乏有效的遗传操作方法，为了研究CtrA是否激活了gst的表达，作者生成了gst启动子-EGFP融合结构，并对含有E.chaffeensis ctrA基因的pACYCDuet-1载体（pACYCDuet-1-rCtrA）或仅含pACYCDuet-1载体（阴性对照）的大肠杆菌BL21（DE3）细胞进行转化。IPTG诱导的rCtrA表达导致携带gst启动子-EGFP结构的细菌中EGFP表达明显高于载体对照，而对携带p28启动子-EGFP结构的细菌无影响（图2D）。这些结果表明，CtrA激活了E.chaffeensis中gst的表达。

图2 CtrA结合到gst启动子区域，在氧化应激时激活gst的表达

接下来，作者确定了体外GST、GshA和GshB的功能。作者在体外表达了GST、GshA和GshB，随后通过GSH-CDNB偶联形成、Pi的形成测定了体外蛋白的酶活性（表1；图3）。结果表明，E.chaffeensis rGST具有功能性，其对GSH的Km值与之前报道的A.tumefaciens GST的Km值在相似的范围内；并且SUMO-rGshA和rGshB具有功能，L-Glu和L-Gly的Km值与A.tumefaciens GshA和大肠杆菌GshB的Km值在相似的范围内。这些结果表明GST、GshA和GshB是E.chaffeensis中的一种功能酶，催化GSH与其典型底物CDNB的偶联。

图3 E.chaffeensis GST、GshA和GshB在体外的酶活实验

由于E.chaffeensis GST在体外具有功能，作者随后研究了其在体内的功能。作者设计了特异性结合到gst翻译起始密码子后区域的GST PNA，GST PNA在36 h p.i时显著降低了gst mRNA水平（图4）。然后，作者研究了GST表达的降低是否影响氧化应激下细菌的生存。在36 h p.i.时，将感染的THP-1细胞在37℃下用100 mM H₂O₂处理2 h。经GST PNA转染的E.chaffeensis存活能力显著低于经H₂O₂处理的E.chaffeensis CTL PNA（图5A），这表明gst对E.chaffeensis应对氧化应激至关重要。

作者还测定了转染GshA PNA或GshB PNA的E.chaffeensis在氧化应激下的生存能力。作者设计了GshA PNA和GshB PNA，同样发现转染无细胞E.chaffeensis的GshA PNA或GshB PNA在36小时后显著降低gshA或gshB mRNA水平（图4）。36h p.i时，用H₂O₂处理感染的THP-1细胞，转染GshA PNA或GshB PNA的E.chaffeensis的生存能力也显著低于转染CTL PNA的E.chaffeensis（图5B，C）。综上所述，GSH的合成和利用是E.chaffeensis应对氧化应激的关键。

图5转染GST PNA（A）、GshA PNA（B）或GshB PNA（C）后E.chaffeensis生存能力检测

04  总  结

Ehrlichia Chaffeensis是人单核细胞埃利希体病（HME）的病原体，是一种革兰氏阴性强制性细胞内细菌，在人单核细胞和巨噬细胞中感染和繁殖。宿主免疫细胞在感染后产生活性氧（ROS）来消灭E.chaffeensis。在本研究中，作者发现E.chaffeensis中CtrA在氧化应激时激活谷胱甘肽s -转移酶（GST）的表达，而E.chaffeensis gst利用GSH清除ROS，使其具有抗氧化应激能力。随后，利用染色质免疫沉淀偶联深度测序（ChIP-seq），作者发现CtrA与211个基因的启动子区结合，包括gst、gshA和gshB并激活这些基因的表达，而这些基因的表达降低能够抑制E.chaffeensis应对氧化应激。