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项目文章 | Rep1结合半乳糖分子招募转录激活因子Cga1调控白念珠菌半乳糖代谢的分子机制

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题      目:Recognition of galactose by a scaffold protein recruits a transcriptional activator for the GAL regulon induction in Candida albicans

发表日期:2023年2月1日

发表期刊:eLife

影响因子:8.713

实验方法:ChIP-seq、Co-IP、IP-MS等

2023年2月1日武汉大学逯杨/苏畅团队题在eLife(IF:8.713)发表了为“Recognition of galactose by a scaffold protein recruits a transcriptional activator for the GAL regulon induction in Candida albicans”文章。该研究发现共生病原真菌Ndt80家族的转录因子Rep1与半乳糖分子直接结合后,招募转录激活因子Cga1,共同调控白念珠菌半乳糖代谢基因的表达。爱基百客为该研究提供ChIP-seq的技术支持

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研究背景


非致病性模式生物酿酒酵母中的GAL途径(半乳糖代谢信号通路)长期以来一直是理解真核生物代谢途径的调控模式如何演变的模型系统。虽然Gal4模式在酵母菌科分支中已经得到了很好的描述,但对其他酵母(比如致病性模式生物白念珠菌)中GAL通路的调控知之甚少。在该研究中,作者发现Rep1,一个Ndt80样家族转录因子,在共生致病性真菌白色念珠菌中作为半乳糖传感器。它出现在GAL基因启动子上,独立于半乳糖的存在。Rep1通过直接的物理相互作用来识别半乳糖,但如何调控半乳糖代谢的分子机制还尚不清楚。

技术路线



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研究结果


1、白色念珠菌半乳糖信号传导需要Rep1

已有研究Rep1被证明是白色念珠菌中GlcNAc信号传导的转录因子。GlcNAc可以诱导白色念珠菌中的半乳糖代谢基因,参与GlcNAc信号传导的关键调节因子可能对半乳糖的利用至关重要。作者通过敲除NGS1发现并没有显示出半乳糖显著生长缺陷。相反,在相同条件下,Rep1突变细胞的生长速度比野生型细胞慢得多(图1A)。为了测试REP1是否调节半乳糖信号传导,作者测量了GAL基因的表达。在Rep1突变株中,半乳糖存在下GAL1和GAL10的表达显著降低(图1B)。在ADH1启动子下的野生型Rep1可以挽救Rep1突变体的缺陷(图1A和B)。尽管REP1对于半乳糖诱导GAL基因是必不可少的,但敲除Rep1会导致甘油中GAL1和GAL10的表达略有增加,并且回补REP1到REP1突变体中可以来消除这种增加。

Rep1包含Ndt80家族家族的DNA结合结构域被定义为该家族转录因子。除了转录因子的常规转录激活结构域(AD)和DNA结合结构域(BD)外,Rep1蛋白中还出现了羧基末端延伸(C)(图1C),这将Rep1与其他Ndt80转录因子区分开来。为确定Rep1关于半乳糖利用的功能特异性是否是C结构域的存在,作者设计了一种嵌合构建体,其中来自Rep1的C结构域在其C末端与Ndt80蛋白融合。这种嵌合构建体未能恢复Rep1突变体的生长缺陷,这表明,除了C结构域外,Rep1在半乳糖诱导下的转录活性的调节也发生在蛋白质的其他地方。嵌合构建体的蛋白质水平与野生型Rep1相当。因此,作者分析了单个Rep1结构域的作用。结果发现从Rep1中去除C结构域(Rep1∆C)未能恢复Rep1突变体在半乳糖上的生长缺陷(图1C)。单独的C结构域也没有任何功能(图1C)。而且将缺乏该结构域的截短体(Rep1∆AD)引入Rep1突变体中,在半乳糖上的生长速度与全长Rep1的生长速度相当(图1C)。这说明Rep1的转录激活结构域对其半乳糖反应性不是必需的。Rep1∆AD也可以诱导GAL基因对半乳糖的表达,尽管在这种截短中观察到的表达水平略低于其全长对应物的表达水平(图1D)。这些结果表明,Rep1的转录激活结构域对于白色念珠菌的半乳糖信号传导不是必需的。


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图1.Rep1对白色念珠菌中半乳糖的利用至关重要

2. Rep1与半乳糖的结合对GAL基因的诱导至关重要

半乳糖不能提高Rep1的蛋白质水平,Rep1是如何提供半乳糖反应性的?ChIP-seq显示,Rep1与半乳糖调节基因 GAL1和GAL10的启动子区结合(图2A)。AlphaFold2预测Rep1包含假定的半乳糖凝集素样折叠(图2B)。鉴于半乳糖凝集素是基于其半乳糖苷结合活性发现的,作者假设Rep1具有与半乳糖相互作用的能力。作者纯化了重组Rep1∆AD-His蛋白(图1C),发现与半乳糖缀合的琼脂糖,能够降低重组Rep1∆AD-His(图2C)。当在与半乳糖-琼脂糖孵育之前向细胞裂解物中加入游离半乳糖时,半乳糖-琼脂与Rep1∆AD-His的结合几乎完全消除(图2C)。

为了了解Rep1∆AD和半乳糖之间的分子相互作用,作者使用AutoDock Vina进行了分子对接,发现半乳糖与Rep1∆AD上的shallow pocket结合(图2D)。三个Rep1∆AD残基参与了与半乳糖的相互作用网络。其中,Y526被认为是相互作用的核心,因为它出现在半乳糖附近,并参与与半乳糖的氢键相互作用和疏水相互作用(图2D)。因此,作者在Rep1∆AD中用丙氨酸取代了Y526,并发现这种突变在体内和体外都不会改变Rep1AD的蛋白质水平。如图2C所示,用丙氨酸取代Rep1∆AD-His中的Y526几乎完全消除了与半乳糖的相互作用。等温滴定量热法(ITC)进一步证实了Rep1∆AD-His和半乳糖之间的直接结合(图2E),而Rep1和葡萄糖、GlcNAc或阿拉伯糖之间的相互作用无法检测到,表明这种结合对半乳糖是特异性的。与免疫沉淀分析一致,在ITC分析中,Y526A突变体未显示出与半乳糖的可检测相互作用(图2E)。但通过将Y526A突变为丙氨酸可以破坏Rep1∆AD和半乳糖之间的相互作用,导致半乳糖的严重生长缺陷(图2F),以及GAL基因表达诱导缺陷(图2G)。因此,Rep1通过直接的物理相互作用识别半乳糖,这对半乳糖信号传导至关重要。

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图2.半乳糖与Rep1的结合是半乳糖信号传导所必需的。

3. Rep1对半乳糖的识别能够募集Cga1进行转录激活

为确定Rep1是否具有转录活性。作者通过单杂交系统技术没有发现Rep1的激活活性,Ndt80可作为转录激活剂(图3A)。鉴于Rep1本身不具有转录活性,作者提出了一个关于GAL基因激活的分子作用模式的假定模型:Rep1和半乳糖之间的相互作用是将转录激活剂(X)募集到GAL基因启动子的先决条件,从而使转录激活发生(图3B)。

然后通过IP-MS分析得到鉴定的独特或高度富集的蛋白质(图3C)。作者重点关注了Orf19.4959,它在念珠菌基因组数据库(CGD)中被描述为具有潜在的DNA结合转录因子活性。通过敲除实验发现缺乏Orf19.4959的细胞不能利用半乳糖(图3D),也不能诱导GAL基因的表达(图3E),这与Rep1突变体的表型相似。

接下来作者通过体内免疫沉淀分析未检测到Cga1-Myc和Rep1-FLAG之间的相互作用(图3F)。ChIP实验表明,与组成性存在于GAL基因启动子上的Rep1不同,Cga1与GAL1-GAL10启动子的结合只能以Rep1依赖的方式从半乳糖生长的细胞中检测到(图3G)。这些结果表明,Cga1本身不能结合GAL启动子,但可以以依赖于半乳糖存在的方式被Rep1募集。与Rtg1和Rtg3在白色念珠菌中对半乳糖利用是可有可无的结果一致,Rtg1或Rtg3突变株在Rep1的启动子结合以及随后半乳糖诱导的Cga1募集到GAL基因启动子上没有显示出任何缺陷。这些体内和体外免疫沉淀实验表明,Rep1在半乳糖结合时直接将Cga1募集到GAL基因启动子,并且Cga1负责随后的转录激活。


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图3.Rep1对半乳糖的识别使Cga1的募集能够激活转录。

4. Rep1的AD结构域负责募集Ngs1进行GlcNAc应答性转录

研究表明,Rep1将GlcNAc信号传导的传感器-转换器Ngs1招募到靶启动子。尽管Rep1的AD结构域对于半乳糖信号传导不是必需的,但它对于细胞对GlcNAc的反应是必需的,因为敲除该结构域的会导致生长缺陷在GlcNAc中(图4A),并降低了GlcNAc诱导的GAL基因表达(图4B)。此外,作者发现Ngs1对于响应GlcNAc的GAL基因诱导也是必要的(图4B)。事实上,在从Rep1中敲除AD结构域后的Co-IP实验中,没有检测到Rep1-Myc和FLAG-Ngs1之间的相互作用(图4C)。这些结果表明,Rep1采用不同的结构域来募集Cga1和Ngs1,这将白色念珠菌中的半乳糖和GlcNAc分解代谢联系起来。

5. Rep1顺式调控基序和靶基因的鉴定

Rep1和Ndt80都属于Ndt80样转录因子家族。Rep1调节半乳糖和GlcNAc分解代谢,而Ndt80是生物膜形成的主要调节因子。Rep1的ChIP-Seq得到富含腺嘌呤的基序(图4D),这与之前报道的Ndt80(CACAAA)不同。ChIP-Seq测定中,半乳糖分解代谢基因(GAL1、7和10)和GlcNAc分解代谢基因的DAC1和NAG1均被鉴定为Rep1的直接靶标。GO分析得到包括对细胞外刺激的反应、碳水化合物代谢过程、细胞器分解不同过程中富集(图4E)。ChIP-Seq结合qRT-PCR数据分析在GlcNAc分解代谢基因DAC1和NAG1中观察到Rep1介导的对半乳糖的转录激活反应(图4)。证实Rep1在转录中的抑制作用。这些发现表明,无论这些基因是否具有转录活性,Rep1都与其靶启动子结合。作者推定 Rep1提供了一个支架来募集不同的转录调节因子,从而使转录激活能够响应环境或发育信号。


6. Rep1介导的半乳糖传感机制在真菌中的保护作用

为确定白色念珠菌中GAL调节子的Rep1-Cga1调节模式后是否在真菌中被广泛利用。BLAST分析发现Rep1正向同源物存在于CTG分支和属于Eurotiales分支的巢状曲霉中(图4F)。Cga1的分布模式几乎与Rep1一致(图4F),这表明Rep1-Cga1对半乳糖利用的调节模式应仅限于与念珠菌分支关系最密切的物种。为进一步确定Rep1 othologs的功能在CTG物种中是否保守,作者检测了热带假丝酵母或近psilosis假丝酵母中Rep1补充白色念珠菌突变体中半乳糖利用缺陷的能力。跨物种实验表明,异位表达的CtREP 1或CpREP1挽救了CaRep1突变体在半乳糖上的生长缺陷,并部分挽救了半乳糖分解代谢基因诱导的缺陷。类似地,将CtCGA1或CpCGA1的WT拷贝引入Cacga1突变体中也可以挽救其半乳糖利用的缺陷。结果表明,由Rep1和Cga1介导的半乳糖传感和信号转导在CTG物种中发生转化。

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图4.Rep1提供了一种通过其相关伴侣调节靶基因的支架。



小  结


酵母的GAL途径长期以来一直是理解真核代谢途径调节模式如何进化的模型系统。虽然在酵母科分支中已经很好地表征了Gal4模式,但对其他酵母中GAL途径的调节知之甚少。在这里,作者发现Rep1,一种Ndt80样家族转录因子,在共生致病真菌白色念珠菌中充当半乳糖传感器。它存在于GAL基因启动子处,与半乳糖的存在无关。Rep1通过直接的物理相互作用识别半乳糖招募转录激活剂Cga1(念珠菌半乳糖基因激活剂,orf19.4959)调控GAL基因的转录进行。Rep1和Cga1在整个CTG物种中是保守的。Rep1本身不具有转录活性。相反,它提供了一个支架来募集不同的转录调控因子。Rep1-Cga1调控模式代表了真菌网络重组的一个新例子,这为白色念珠菌如何进化转录程序以定植不同的宿主生态位提供了见解。



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