项目文章 | IF>6! ATAC-seq联合RNA-seq揭示转录因子AGL18通过乙烯-生长素交互作用调控番木瓜成熟

期刊：Postharvest Biology and Technology

影响因子：6.751

爱基提供技术：ATAC-seq及联合分析

选择同时期（相同色阶比例）大小相似且无机械损伤的番木瓜，共分为三组：1-MCP 400 nL/L处理2 h, 1-MCP 400 nL/L处理16 h，对照1-MCP 0 nL/L；之后用1uL/L乙烯利处理1min，在1d以及6d后收获。

番木瓜（Carica papaya）是典型的呼吸跃变型水果，在成熟过程中多种生理变化迅速发生。乙烯在此过程中促进水果成熟发黄软化，乙烯受体抑制剂1-methylcyclopropene (1-MCP)可显著延长香蕉、苹果、木瓜等水果的成熟时间。应用适当剂量的1-MCP会延缓木瓜果实的着色和软化，而不当使用1-MCP处理会导致木瓜的异常成熟为“橡胶质地”。因此，这一现象严重限制了1-MCP在采后木瓜产业中的应用。前人研究结果表明乙烯和生长素可相互作用调节果实成熟，但在番木瓜果实成熟过程中生长素和乙烯的相互作用以及调控分子机制尚不清楚。

华南农业大学园艺学院李雪萍教授和朱孝扬教授团队针对1-MCP不同处理时间点利用ATAC-seq评估成熟过程中染色质可及性差异，RNA-seq探究差异表达基因，通过联合分析锁定关键转录因子CpAGL18，再经EMSA、亚细胞定位、酵母单杂（Y1H）、ChIP-qpcr以及双荧光素酶报告基因验证CpAGL18与CpACS1以及 CpSAUR32的结合。说明转录因子AGL18通过乙烯-生长素交互作用在番木瓜成熟过程中发挥关键作用。

1. ATAC-seq探究染色质可及性

收集1-MCP处理后1d的木瓜果实样品进行ATAC测序分析（每个样本2 repeat），相关性分析表明了取样和数据的可靠性。相比于对照样本，1-MCP 2 h和16 h处理的样品中分别鉴定了总共1179和1219个DARs。1-MCP处理16 h和2h比较鉴定了592个DARs(Fig.1 C)。

Fig.1 C不同1-MCP处理下差异区火山样图

2. 不同处理DARs在基因组分布特征

1-MCP 2h vs control 1179个DARs中，上调的染色质可及性区域分布有50.09%在基因间和24.13%在启动子区域，下调染色质可及性区域有81.01%位于基因间，13.35%位于启动子区(Fig. 2 A，B)。在1-MCP 16h vs control的样品之间的1219个DARs，上调染色质可及性区域位于基因间区和启动子区域分别是32.69%和14.74%，在染色质可及性降低的DARs中，58.21%和36.16%的可及性染色质分别位于基因间区和启动子区(Fig. 2C，D)。1-MCP 16 h vs 1-MCP 2 h中鉴定得到529 DARs中，上调89.06%和6.25%的染色质可及性区域分别位于基因间区和启动子区；同时，下调的染色质可及性区域中有81.01%和13.35%分别位于基因间区和启动子区(Fig. 2E，F)。在1-MCP处理的样品中，染色质可及性区域主要位于基因间区和启动子区，对启动子有密切影响。在用1-MCP处理16 h的样品中，下调DARs中的启动子区域占比较高。这些结果表明1-MCP处理后显著改变了染色质的可及性。

图2 不同处理条件下番木瓜果实样品之间ACR在基因组位置区域的分布

3. DARs的KEGG通路分析

通过对ATAC-seq获得的DARs 进行KEGG富集分析，1-MCP处理下番木瓜果实中上调DARs主要富集光合作用以及氧化磷酸化途径，其次是RNA聚合酶和脂肪酸代谢途径(Fig. 3A)。下调的DARs主要富集在了植物激素信号转导途径(Fig. 3B)。1-MCP处理16h引起的异常成熟样品的上调DARs富集到膜运输和转录机制 (Fig. 3C)；下调的DARs富集在植物激素信号和转录因子(Fig. 3D)。在1-MCP 2h vs1-MCP 16h上调DARs富集在植物激素信号转导(Fig. 3E)，而下调DARs富集在光合作用以及氧化磷酸化(Fig. 3F)。

Fig. 3 不同1-MCP处理下DARs注释基因的KEGG富集分析

4. 调节番木瓜成熟差异转录因子分析

DARs注释结果显示，1-MCP处理样本与对照相比较，下调的转录因子的数量远多于上调的。在1-MCP 2 h vs control下调的转录因子以MADs-M型最多。在1-MCP 16 h vs 1-MCP 2 h上调的TFs中，MADs-M型是唯一差异表达的转录因子。1-MCP处理显著影响成熟过程中的其他转录因子，如MYB、NAC和AP2/ERF-ERF。这些结果表明1-MCP显著影响关键转录因子的表达，从而影响番木瓜果实的成熟。

表1 不同1-MCP处理间TFs的分布

5. ATAC-seq和RNA-seq的联合分析

依据番木瓜基因组注释信息，对变化的染色质可及性区域进行注释。1-MCP 2h vs control有342个上调的DARs和857个DEGs被注释；242个下调的DARs和589个DEGs也被注释。1-MCP 16h vs control有79个上调的DARs和1674个DEGs注释，712个下调的DARs和1578个DEGs注释。其中，185个基因在可及的染色质和转录组中显示出差异。此外，在1-MCP 16h vs 1-MCP 2h注释到了16个上调的DARs和345个DEGs，以及347个下调的DARs和532个DEGs。这些差异变化可能在成熟过程和1-MCP处理后成熟障碍中起重要作用。

Fig. 4 不同1-MCP处理的番木瓜果实染色质可及性和基因表达的差异分析

6. RT-qPCR验证ATAC-seq和RNA-seq鉴定得到的关键基因

根据筛选得到的DEGs选择了几个与乙烯信号途径(CpEIL3、CpERF113和CpACS2)和生长素信号途径(CpWAT1、CpSAUR32/50、CpPIN、CpTIR1)相关的基因以及CpAGL18(MADS)进行 RT-qPCR验证。CpACS1、CpEIL3、CpERF113、CpSAUR32、CpSAUR50、CpTIR1和CpAGL18的表达水平在1-MCP 2h后增加，然后在1-MCP 16h降低(Fig. 5)。1-MCP处理显著抑制了它们的表达水平，特别是在16h处理下。生长素相关基因PIN和WAT有着相似的表达趋势，表达量随着成熟下降；但用1-MCP处理时表达量增加。

Fig. 5 RT-PCR对候选基因的表达验证

ATAC-seq和RNA-seq联合分析可视化展示，1-MCP 2h vs control 中CpAGL18和CpSAUR32的开放染色质和差异基因有所降低，CpACS1和CpAGL18染色质开放和差异基因表达在1-MCP 16h中减少，而CpAGL18在1-MCP 2h和1-MCP 16h中均有差异变化 (Fig. 6)。

Fig. 6 ATAC-seq和RNA-seq.联合分析可视化展示图

7. CpAGL18结合并激活CpACS1和CpSAUR32

RNA-seq中CpAGL18表达情况说明其在番木瓜果实成熟过程中起着关键作用。RNA-seq和ATAC-seq联合分析关键基因中CpACS1和CpSAUR32具有MADS结合位点。亚细胞定位结果显示CpAGL18共定位于细胞核和质膜(Fig. 7A)。酵母单杂结果显示CpAGL18与CpACS1、CpSAUR32的启动子结合(Fig. 7B)。双荧光素酶报告基因结果显示，当CpAGL18可结合CpACS1和CpSAUR32并且激活CpACS1和CpSAUR32的表达。这些结果表明CpAGL18结合并激活CpACS1和CpSAUR32 (Fig. 7C)。

Fig. 7 CpAGL18与其靶基因相互作用验证

EMSA证实 CpAGL18结合CpACS1、CpSAUR32的启动子CarG-box元件 (Fig. 8A)。ChIP-qPCR实验结果表明在植物体内 CpACS1和CpSAUR32的启动子区域中显著富集(Fig. 8B)。这些结果证实CpAGL18与番木瓜中CpACS1和CpSAUR32的启动子结合。

Fig. 8 EMSA、ChIP-qpcr验证CpAGL18与其靶基因结合

CpAGL18分别结合并调节乙烯通路相关基因CpACS1 以及生长素相关基因CpSAUR32的表达，并且它们的相互作用在调节果实成熟中起重要作用。对于这些基因的功能和调控网络还需进一步深入探究。