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转录因子调控 | Nature子刊BRD9介导的染色质重塑通过负反馈机制抑制破骨细胞形

含溴结构域蛋白(bromodomain-containing protein,BRDs)是一类进化上高度保守的蛋白,可通过识别组蛋白的乙酰化赖氨酸残基,并与之特异性结合从而参与调控基因转录和染色质重塑等生命过程,是近些年靶向药物研究的热点。上海交通大学医学院附属第九医院蒋欣泉教授团队近期在Nature Communications杂志上发表题为“BRD9-mediated chromatin remodeling suppresses osteoclastogenesis through negative feedback mechanism”的研究论文。该研究利用表观多组学(ChIP-seq+ATAC-seq+RNA-seq)和机理表型实验探究了BRD9(bromodomain-containing protein 9)在破骨细胞形成机制中的作用。

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  • 前  言


骨的功能和稳态依赖于平衡的骨重塑过程,这是一个由成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收的连续循环过程。骨重塑过程是经过精心策划的,它们的失衡会扰乱骨骼结构,引起骨质疏松、骨石化、骨坏死、Paget’s病等骨骼疾病。破骨细胞是造血髓系,来源于骨髓源性单核细胞(BMDMs)。在过去的几十年里,大量文献证明破骨细胞的发生是由骨微环境中的核因子κB受体激活剂(N F -κB)配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)启动的,再经过活化、增殖、融合、成熟等一系列过程,最终分化的多核破骨细胞开始分泌抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K (CTSK)、基质金属肽酶9 (MMP9)等蛋白酶和酸,进行骨吸收活性。

上述破骨细胞谱系的承继和分化是由复杂的信号转导级联调控的,这些信号转导级联汇聚到转录调控。哺乳动物BRG1相关因子(BAF)复合物是ATP依赖的染色质重塑体,由多个蛋白亚基组成,可易位核小体并通过DNA结合因子调节基因转录。多项证据表明,BAF复合体在控制启动子和增强子区域与造血发育过程相关的基因表达方面起着重要作用,以及其在抑制人类多种癌症方面的广为人知的功能。特别是bromodomain-containing protein 9 (BRD9),一种独特的非典型BAF (ncBAF)复合物的关键成分,在骨髓系确定和巨噬细胞炎症反应中至关重要。破骨细胞起源于髓细胞,在造血谱系中与巨噬细胞有共同的祖先。然而,几乎没有证据表明BRD9介导的染色质重塑与骨稳态中破骨细胞谱系分化之间存在关联。

在此,作者结合干湿实验(测序+表型验证)发现了BRD9-FOXP1-STAT1轴对破骨细胞形成中的负反馈信号至关重要,扩展了对染色质重塑因子、转录因子和骨稳态信号通路之间复杂相互作用的认识,并强调了其对骨病的治疗潜力。

  • 研究结果

一、特征基因表达量与表型实验研究BRD9与破骨细胞之间的关系

4周龄小鼠股骨远端小梁表面CTSK +破骨细胞中BRD9高表达,且M-CSF和RANKL的外界刺激能够诱导BRD9表达上调。μCT、H&E染色、Von Kossa染色等表型实验表明BDR9缺失(BDR9敲除小鼠LysM-Cre;BRD9fl/fl)会造成小鼠骨量、矿化、骨密度等指标减少(图1)。

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图1 髓系Brd9缺失导致骨量减少

LysM-Cre;BRD9fl/fl小鼠在4周龄时股骨骨表面的破骨细胞数量增加,来自LysM +髓系的CTSK +破骨细胞(Tdt +CTSK +细胞)在股骨骨表面的细胞数量明显增加,表明BRD9缺失后,破骨细胞承继和骨吸收增强。此外,骨小梁表面碱性磷酸酶(ALP)的表达和RUNX2 +成骨细胞的数量表明LysM-Cre;BRD9fl/fl骨表面被侵蚀的程度更高。BRD9消融后增强的破骨细胞谱系会加速骨吸收,导致过度的骨量损失(图2)。

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图2 髓系中Brd9的缺失导致体内破骨细胞谱系的增强

RANKL体外诱导LysM-Cre;BRD9fl/fl小鼠发现,BRD9耗尽的BMDMs中TRAP +多核细胞的数量和大小增加,破骨细胞特异性基因Acp5、Ctsk和Mmp9的表达增加。BRD9的选择性细胞化学抑制剂iBRD9(图3)以及PROTAC BRD9化学降解剂dBRD9(图7)处理后有同样趋势,且依赖rankl的表达。

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图3 BMDMs中BRD9的缺失和抑制导致体外破骨细胞生成过度激活

综上所述,这些结果表明,经RANKL处理后上调的BRD9以负反馈机制抑制RANKL诱导的破骨细胞分化,BMDMs中基因缺失和抑制BRD9均能持续促进破骨细胞分化。

二、BRD9调控破骨细胞形成的下游机制挖掘

M-CSF+RANKL+破骨细胞分化过程中BRD9抑制1天后BMDMs (MR + iBRD9)与对照组(MR +载体)的转录组测序数据显示,差异基因功能主要在防御反应、对干扰素-β (IFN-β)和外界刺激的反应、免疫系统过程及其拓扑关系(有向无环图(DAG))上高度富集。GSEA进一步揭示了IFN-β反应、乙酰胆碱受体信号转导、MR + iBRD9组的核糖体生物发生、突触传递和rRNA加工均上调。且IFN-β信号通路活性是BRD9抑制后最主要的下调信号通路之一。因此,作者推测BMDMs中IFN-β信号的转录下调可能在一定程度上促进了BRD9抑制后的破骨细胞过度生成。体外增加IFN-β1的破骨细胞生成实验以及相关基因表达量检测验证了这一点(图4)。

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图4 brd9介导的干扰素-β信号的转录激活负调控破骨细胞的发生

为了进一步阐明在rankl诱导的破骨细胞形成的负反馈过程中BRD9是如何参与转录调控的,作者使用免疫沉淀(ChIP)测序分析比较了MR + iBRD9组的down基因与BRD9在破骨细胞形成过程中BMDMs中的结合谱并与转录组结果进行了关联。其中STAT1作为相互作用数最多的枢纽基因之一,是IFN-β信号通路活性的主要中介,在rankl诱导后增加,在LysMCre;BRD9fl/fl小鼠中表达降低。因此,作者假设Stat1是BRD9介导的破骨细胞发生负反馈的关键下游靶点之一。小鼠巨噬细胞RAW264.7是研究破骨细胞形成分子机制的首选模型。在对照组和iBRD9抑制剂处理的stat1过表达RAW264.7细胞中,破骨相关基因如Mmp9和Acp5的表达相当,而对照组Mmp9和Acp5的表达明显增加,表明Stat1的下调表达可能是BRD9抑制介导的过度破骨细胞形成的关键过程。随后,通过双荧光素酶实验与ChIP-qPCR实验验证了BRD9可以直接结合Stat1的启动子(2.6 kb,−1995 ~ +575)和增强子(1.2 kb,−6338 ~−5138)。表明BRD9通过直接调节Stat1的启动子和增强子活性来促进Stat1的转录,进而调控破骨细胞的负反馈(图5)。

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图5 STAT1对破骨细胞发生过程中brd9介导的负反馈至关重要

三、BRD9作为染色质重塑因子的延伸研究

作为ncBAF复合体的关键组成部分,BRD9的生物学作用在很大程度上取决于协同作用的TF和特定的环境。为了研究BRD9的染色质重塑功能以及可能促进BRD9在破骨细胞形成中的负面作用的辅助因子,作者进行了ATAC-seq并与ChIP-seq联合分析。结果显示MXI1、SRY、Arid3a、ZNF354C、FOXP1等与BRD9有潜在的协同作用并且可能通过STAT1/IFN-β信号通路参与破骨细胞发生调控。

基于FOXP1前期研究发现过表达人FOXP1减弱了转基因小鼠的破骨细胞发生和骨吸收活性,作者选择了FOXP1进行后续研究,并利用coIP验证了FOXP1与BRD9的互作关系。为了进一步验证FOXP1对Stat1的结合和转录调控功能,作者利用慢病毒载体进行了ChIP-qPCR和FOXP1敲低实验。结果发现FOXP1可以直接与Stat1启动子和增强子结合,且抑制BRD9后FOXP1在Stat1的结合功能受损。这表明FOXP1是BRD9在Stat1转录激活和破骨细胞分化过程中负反馈调控的关键辅助因子之一(图6)。

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图6 FOXP1与BRD9相互作用,在破骨细胞发生过程中调节Stat1转录

四、BRD9的功能特异性

据报道,BRD9通过与BRD412合作调节巨噬细胞的激活。与作者发现的BRD9对破骨细胞形成的抑制作用相反,之前的研究表明BRD4抑制了rankl诱导的破骨细胞形成。为了区分BRD9和BRD4的功能特异性,作者比较了破骨细胞形成过程中BRD9降解后与dBRD9的转录谱,以及BRD4抑制剂JQ1抑制BRD4后的转录谱。结果发现破骨细胞相关基因发生明显相反的变化,其中JQ1治疗组细胞周期和破骨细胞分化过程是最主要的改变途径,提示其可能在破骨细胞形成过程中导致dBRD9与JQ1作用相反。但作者并未展开进一步研究。

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图7 | BRD9的功能特异性区别于BRD4

五、dBRD9降解物的临床应用

唑来膦酸钠(ZOL)相关的颌骨骨坏死(ONJ)与拔牙后患者的破骨细胞生成受损有关,需长期服用强抗骨吸收剂。此外,最近的研究也揭示了ONJ的发病机制也与巨噬细胞过度活化和炎症过程有关。而目前临床上尚无预防或有效治疗ONJ的方法。鉴于化学制剂PROTAC dBRD9在滑膜肉瘤和白血病的临床前模型中显示的疗效,作者推测dBRD9降解物的局部治疗具有促破骨细胞发生和抗炎反应的特征,可以有效地预防或减轻ONJ。

为了验证这一假设,作者通过对6周龄WT C57BL/6J小鼠进行ZOL (125 μg/kg体重;每周两次)和地塞米松(DEX)(5mg/kg体重;每周一次)的4周注射。且第一次注射ZOL/DEX两周后,拔除小鼠上颌左第一磨牙。随后作者构建了含BRD9降解物的改良可注射光固化蚕丝蛋白(SF),并在拔牙后立即将其填充到牙槽骨窝中,以含SF的载体为对照组。两周后,收集各组上颌骨进行评估。μCT成像、组织学检查、TRAP染色以及iNOS免疫荧光染色显示,dBRD9降解物处理组愈合的拔牙窝骨表面局部参与骨重构的破骨细胞增多且拔牙窝骨表面炎症反应局部缓解。此外,rankl诱导的破骨细胞发生和脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞激活过程中,ZOL治疗可导致BMDMs中BRD9的表达上调,提示dBRD9应用于zol诱导的ONJ是一种潜在的理想的肿瘤治疗方法(图8)。

此外,BRD9缺失小鼠对LPS/刺激的牙周牙槽骨局部急性损伤表现出明显的抗性,dBRD9对LPS诱导的急性牙周炎和牙槽骨丢失具有预防和治疗潜力(图9)。

总的而言,作者设计了一种用于拔牙缺损的局部骨再生系统,能够有效预防和缓解ZOL相关的ONJ和增强对局限性侵袭性牙周炎的抗炎作用。

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图8 BRD9降解物减轻拔牙后zol相关的ONJ

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图9 BRD9缺失/降解物减轻脂多糖诱导的骨吸收

  • 文章总结

本期,我们和大家分享了一篇BRD9介导的染色质重塑通过负反馈机制抑制破骨细胞形成的研究文章,含溴结构域蛋白在靶向药物开发中一直是研究的热门领域,尤其是抗肿瘤、抗炎、治疗心血管疾病等方向,这篇文章对临床方向的老师有不少值得参考的思路。

1、挖掘了BRD9对破骨细胞的调控机制

2、多种干湿实验结合,丰富文章的故事性与可信度

3、结合机理研究与临床表型实验,加强了分子实验在临床上的应用前景


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文献链接:DOI: 10.1038/s41467-023-37116-5

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