项目文章 | ChIP-seq、DAP-seq和全转录组联合分析探究油柿MeGI转录因子的调控机制

转录因子参与种子萌发、生长和发育、开花、衰老以及抗逆，寻找转录因子下游靶基因，探究其调控机制并绘制调控网络一直是植物领域的热门研究方向之一。ChIP-seq和DAP-seq是目前常用的蛋白质与DNA互作研究方法，两种方法都有各自的优点和局限性。本期我们分享一篇结合这两种方法来研究转录因子调控机制项目文章，对于植物尤其是非模式植物的方向的老师有比较大的参考价值。

发表单位：中国林业科学研究院经济林研究所

发表日期：2023年2月22日

期刊：Frontiers in Plant Science（IF₂₀₂₂=6.627）

2023年2月22日，中国林业科学研究院经济林研究所孙鹏/李芳东/傅建敏团队在Frontiers in Plant Science（IF₂₀₂₂=6.627）上在线发表了题为“Regulatory mechanism of MeGI on sexuality in Diospyros oleifera”的研究论文。该研究综合ChIP-seq、DAP-seq、RNA-seq和EMSA等技术发现转录因子MeGI主要通过调节昼夜节律、水杨酸生物合成和类黄酮生物合成途径中的基因来调控油柿的性别控制功能。爱基百客为该研究提供ChIP-seq的技术支持。

• 研究背景

雌雄异株系统是维持遗传多样性的重要策略。转录因子 MeGI 通过促进君迁子（Diospyros lotus）和柿（D. kaki.）的雌蕊发育来促进雌雄异株。然而MeGI在油柿（D. oleifera）中的功能尚未确定。本研究证实了油柿的MeGI基因能抑制拟南芥雄蕊的发育。染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq)、DNA 亲和纯化测序 (DAP-seq) 和 RNA-seq 联合分析鉴定MeGI的靶标基因，结果表明MeGI通过调节昼夜节律相关基因（如TOC1、FKF1、PRR5、ELF4和BBX13）的表达来调控花芽的分化。此外，还通过EMSA验证了MeGI与GRP3和WRKY28启动子区的结合作用。

• 研究材料

4月中旬同一发育阶段的油柿雄花和雌花花蕾、拟南芥。

• 研究思路

• 研究结果

 1. MeGI序列分析

在本研究中，作者从油柿雌花的cDNA中克隆了 MeGI 的ORF 序列。有研究报道，MeGI 属于 HD-ZIP TF 家族，因此作者分析了HD-ZIP家族在油柿基因组中的位置，发现60 个 HD-ZIP转录因子分别分布在 15 条染色体上 ，其中 MeGI 分布在 8 号染色体上（图 1A）。MeGI ORF长度为 660 bp，编码 220 个氨基酸。MeGI蛋白的分子量为25.34 kDa，等电点为9.22。系统发育分析表明，油柿MeGI蛋白与君迁子MeGI蛋白亲缘关系最近，与青稞的KAE8792944.1和水稻的KAB8106101.1的亲缘关系较远（图1B）。油柿和君迁子的 MeGI 蛋白序列相似率为97.72%（图 1C）。

图1：HD-ZIP转录因子家族的位置和MeGI蛋白的系统发育分析

2. MeGI蛋白亚细胞定位

在烟草中对油柿MeGI蛋白进行亚细胞定位。共聚焦激光显微镜观察显示，MeGI-GFP融合蛋白在细胞核中发出荧光，DAPI染色同样表明MeGI蛋白位于细胞核中（图2）。

图2 MeGI蛋白在烟草中的亚细胞定位

3. 在拟南芥中异源表达油柿MeGI基因

先前研究表明，在拟南芥中过表达君迁子的MeGI基因抑制了花药和花瓣的发育。为了鉴定油柿中的MeGI 基因功能，作者在拟南芥中过表达油柿的MeGI基因，结果表明，10 株过表达植株中有 3 株雄蕊发育迟缓，其中1株出现了严重矮化的表型（35S-MeGI-10）（图 3A、B、D），然而，这些植物还会产生有活力的花粉粒，当自花授粉时仍可产生可育种子（图 3F）。空载对照和过表达植株中的 MeGI 表达水平如图 3G 所示。总之，转基因拟南芥的表型与油柿雌花的形态一致（图 3H、I）。

图3 过表达MeGI的转基因拟南芥植株表型

4. 全转录组测序鉴定差异mRNAs,lncRNAs和miRNAs

为了研究MeGI调控的下游靶基因，作者构建了pHB-MeGI载体，将其与pHB载体分别转染至第8发育阶段的拟南芥花蕾中，并进行了全转录组测序分析。结果共鉴定出1128个差异基因，包括734下调基因和 394 个上调基因。MapMan分析表明，差异基因主要集中在细胞壁、脂质代谢和次级代谢途径中。此外，还鉴定出 8 个差异 lncRNA和 29个差异miRNA。miRNA 靶基因的预测显示7个miRNA及其靶基因表达水平变化趋势一致（图4）。

图4 pHB-MeGI和pHB中具有不同表达谱的代谢途径

5. ChIP-Seq鉴定MeGI在基因组上的结合位点

为了鉴定MeGI结合位点，对p1306-MeGI-FLAG和p1306-FLAG转基因拟南芥植株进行ChIP-seq。共鉴定出9769个可能与MeGI结合的peak，其中60.63%的peak分布在启动子区，16.09%分布在外显子区，其余peak位于5' UTR、3' UTR、内含子等区域（图5A、B）。这9769 个peak共关联到7604个基因，关联基因的转录因子家族预测结果表明，这些基因主要属于 AP2/ERF、bHLH、MYB 和 WRKY家族。KEGG分析发现，植物激素信号转导、昼夜节律和 MAPK 信号通路高度富集。此外，还发现了118个MeGI的结合基序。

图5 MeGI的ChIP-seq结果分析

6. DAP-Seq鉴定MeGI在基因组上的结合位点

使用MeGI结合Halo-Tag融合蛋白进行DAP-seq，以探究MeGI的靶基因。本实验使用两个生物学重复样本，最终在油柿基因组中鉴定出7531个peak，二者共有846个peak（图6A）。在鉴定出的846个peak中，63个(7.54%)位于启动子区（图6B）。此外，还发现了5个MeGI结合基序（图6D）。最终，作者筛选出 58 个基因，MeGI 与这些基因的启动子结合以调节它们的表达。结合转录组数据分析发现，58个基因中有7个上调表达基因和1个下调表达基因。此外，58 个基因中只有 3 个被预测为转录因子，分别属于WRKY、bZIP、AP2/ERF家族。进一步的 GO 分析表明，分子功能、细胞组分、生物学过程三大类中各包含10、16、9个GO term（图 6C）。

图6 MeGI的DAP-seq结果分析

7. ChIP-seq、RNA-seq和DAP-seq多组学联合分析鉴定MeGI的靶基因

首先作者利用RNA-seq和ChIP-seq数据联合分析，鉴定出368个基因，包括149个上调基因和219个下调基因。KDA分析结果显示，TOC1、FKF1、PRR5、ELF4、BBX13和MEE14等基因是149个上调基因的关键驱动基因（图7B），其中TOC1、FKF1、PRR5、ELF4和BBX13与昼夜节律通路有关；ACS6、WRKY40和BCS1等基因是219个下调基因的关键驱动基因。综上所述，MeGI通过调节昼夜节律相关基因的表达来调节花芽分化。

接下来，作者将DAP-seq鉴定的基因与拟南芥基因组进行比对，以鉴定同源基因。将同源基因与ChIP-seq和RNA-seq联合分析获得的基因进行了比较，找到2个共有基因：GRP3, evm.model.Chr11.1131和WRKY28 ,evm.model.Chr5.1036，这两个基因在MeGI-OX株系中的表达量均高于对照系，并在雌株和雄株油柿中进行了验证（图7C、D）。最后，通过EMSA实验证实MeGI与GRP3和WRKY28的启动子区域相互作用，表明这些基因可以直接被MeGI调控(图7E、F)。

图7 ChIP-seq、RNA-seq 和 DAP-seq 联合分析

8. SA合成、分析和含量测定

已有研究表明，WRKY28和GRP3与SA途径相关，因此，作者推测MeGI通过调节SA生物合成来调节花蕾中的性别分化。SA的生物合成主要涉及两种途径，其中WRKY28主要通过影响ICS、PBS3和EPS1催化的途径调控SA的生物合成（图8A）。转录组结果显示MeGI-OX 植株中的ICS1、ICS2 和 PBS3 的表达量显著低于对照组，EPS1 没有明显差异（图 8B）。这些结果表明 WRKY28 抑制 ICS1、ICS2 和 PBS3 的表达，从而减少 SA 的生物合成。

为了验证这一结果，作者选取了7棵油柿雌花和 7 株油柿雄花花蕾进行SA 含量检测， 结果发现雄花中的SA含量显著高于雌花（图8C），这与MeGI抑制SA生物合成一致，低SA水平促进油柿雄花发育。

图8 SA生物合成途径和SA含量

• 结   论

在本研究中，作者以转录因子MeGI为切入点，主要通过ChIP-seq、DAP-seq、RNA-seq等多组学技术联合分析，以此探究MeGI的调控机制，并提出一种MeGI介导的油柿性别决定模型。本研究为人工诱导优良雄性柿种质资源、高效杂交育种选育新的柿品种提供了理论依据。

图9 MeGI介导的油柿性别决定模型

文献链接：DOI: 10.3389/fpls.2023.1046235

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