目标区域甲基化大队列研究利器—TBS

 往期我们分享了不少关于甲基化的技术科普以及项目文章，今天我们继续带大家了解甲基化的技术——TBS。

DNA甲基化是第一个被发现的表观遗传修饰，是指在DNA甲基化酶的作用下，以S-腺苷酸-L-甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。目前研究较多的是5-甲基胞嘧啶(5mC)。

图1 DNA甲基化示意图

• DNA甲基化在肿瘤研究的应用前景

基因的功能除了依赖于正常结构外，还依赖于甲基化状态。DNA甲基化是较明确的肿瘤表观遗传学修饰机制。DNA的异常甲基化在肿瘤发生中起重要作用，其可导致基因表达谱发生变化，引起肿瘤。DNA甲基化常作为肿瘤诊断、治疗及预后监测的一种生物标志物。此外，异常的 DNA 甲基化也可为肿瘤的治疗提供靶点。

正常和肿瘤DNA甲基化模式示意图

人类基因组中的大多数CpG都被甲基化，在启动子和增强子中未发生甲基化的CpGs为调控相关转录因子(TF)提供结合的机会，并招募与转录激活相关的DNA和组蛋白修饰因子(如组蛋白乙酰化酶(HATs)和易位(TET)蛋白)。相反，甲基化的CpGs与methyl-CpG-binding (MBD) 蛋白结合，这些蛋白募集与基因抑制相关的组蛋白修饰因子(如组蛋白去乙酰化酶(HDACs)和DNA甲基转移酶((DNMTs))。重复序列被甲基化沉默。活性元件中的一些CpGs被羟甲基化。这些模式的改变，都是癌症发生的标志。

因此，DNA甲基化的研究具有很大的应用前景和价值，那么该如何选择甲基化的检测方法。

• DNA甲基化检测方法

DNA甲基化检测方法分为整体DNA甲基化检测（Global DNA methylation assay）以及全基因组位点特异性检测。

A. 全局方法可以细分为检测整体DNA甲基化的方法（LC-MS、HPLC）和利用重复元件的甲基化反映整个基因组DNA甲基化的水平（LINE-1和Alu）。

B.位点特异性方法也可以细分为全基因组方法（WGBS、RRBS和MeDIP等）和特定区域的方法(PCR)（BSP和MSP等）。

亚硫酸氢盐处理后测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）是检测基因甲基化的金标准，接下来我们重点介绍下BSP及其衍生技术TBS。

BSP实验原理

亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶（C）被转化为尿嘧啶（U）而甲基化的C则不变。在需要进行甲基化检测的区域CpG岛两端设计引物进行PCR扩增，将目的产物纯化后进行TA克隆，每个克隆挑取阳性克隆测序，最后将测得的序列与原始序列比对，统计甲基化位点及数量，并分析甲基化程度。

TBS实验原理

TBS是BSP结合NGS高通量测序检测基因甲基化的技术，是对来自同一样本的BSP扩增产物进行混合，并进行标签引物扩增，带上对应测序接头，最终获得每个样本带不同标签的测序文库，上机测序。其具有高准确性、通量高、周期短、低成本的优势，广泛用于临床大样本多位点的甲基化位点筛选与验证。

TBS实验流程图

• 案例分享

文章名称：Targeted Bisulfite Sequencing Reveals DNA Methylation Changes in Zinc Finger Family Genes Associated With KRAS Mutated Colorectal Cancer

期刊：Frontiers in Cell and Development Biology

影响因子：6.081

研究背景：

结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是癌症死亡的主要原因，早期诊断可显著降低结直肠癌的死亡率。以往的研究表明锌指基因(ZFGs)的DNA甲基化状态可能在结直肠癌的早期诊断中具有潜在的价值。然而，目前对于结直肠癌中ZFGs基因的作为Biomarker综合评价还有所欠缺。

研究方法：

首先对1426个全基因组DNA甲基化的公共数据进行分析，其中1104例结直肠癌肿瘤，54例腺瘤和268例癌旁组织。接下来，收集218名CRC患者的两个复制队列中鉴定并验证了差异最大的甲基化ZFG。最后，比较ZFG和SEPT9在所有CRC患者以及KRAS突变患者中的甲基化差异情况。

研究设计流程图

结果与讨论

本研究整合了来自TCGA和GEO数据库的数据集，以确定稳定可信的生物标志物，最终选择确定了五个超甲基化的ZFG（ESR1、ZNF132、ZNF229、ZNF542和ZNF677）作为候选生物标志物，并在汉族结直肠癌患者中进行了验证。ZNF132和ESR1这两个ZFG ESR1[曲线下面积(AUC) = 0.91]和ZNF132 (AUC = 0.93)对CRC的诊断能力与SEPT9 (AUC = 0.91)相当或更好，这表明这两个ZFG在未来是有希望诊断结直肠癌的生物标志物。此外，这些ZFG在KRAS突变组中的检出数量明显高于KRAS未突变组，这表明体细胞突变与DNA甲基化改变之间存在显著关联。此研究结果强调了将基因突变和表观遗传结合对结直肠癌诊断的重要性。

5个目标基因区域甲基化测序（TBS）测序结果

在此作者提到此次研究结果的局限性：使用Illumina HumanMethylation 450K公开的DNA甲基化数据集来确定候选的ZFG，这些数据集仅覆盖了一小部分基因组，而大量基因组仍未被检测到。进一步的研究可能需要使用全基因组亚硫酸盐测序（WGBS-武汉爱基百客可提供相关产品服务）来更好地确定基于DNA甲基化的结直肠癌生物标志物。

最后，此研究仅检测了这些ZFG在肿瘤或肿瘤旁组织中的甲基化谱，而这些ZFG在使用血浆或粪便进行结直肠癌非侵入性诊断中的功效尚不明确，需要进一步探究。

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参考文献

Weilin Pu, Fei Qian, Jing Liu, Keke Shao, Feng Xiao, Qin Jin, Qingmei Liu, Shuai Jiang, Rui Zhang, Jun Zhang, Shicheng Guo, Jianfeng Zhang, Yanyun Ma, Shaoqing Ju, Weifeng Ding. (2021). Targeted Bisulfite Sequencing Reveals DNA Methylation Changes in Zinc Finger Family Genes Associated With KRAS Mutated Colorectal Cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology