IJMS | 利用全外显子组测序鉴定高级别骨肉瘤的新潜在预后和预测标记物

发表单位：比萨大学医药外科新技术转化研究学院

发表日期：2023年6月13日

期    刊：International Journal of Molecular Sciences（IF: 5.6）

2023年6月13日比萨大学医药外科新技术转化研究学院Alessandro Franchi团队在期刊International Journal of Molecular Sciences（IF: 5.6）发表了题为“Identification of New Potential Prognostic and Predictive Markers in High-Grade Osteosarcoma Using Whole Exome Sequencing”的研究论文。该研究结果表明对 ARID1A、CREBBP、BRCA2 和 RAD50 基因突变的鉴定可能有助于对携带这些基因改变的肿瘤采用更具针对性的疗法，其中，BRCA2和RAD50参与同源重组修复，因此可作为聚ADP核糖聚合酶（PARP）抑制剂的特异性治疗靶点。最后，研究发现肿瘤突变负荷是OS的潜在预后标志物。

01 研究背景

传统的高级别骨肉瘤（OS）是最常见的骨原发恶性肿瘤，OS的核型复杂，与肿瘤的发生、发展和耐药性有关的分子机制在很大程度上仍不清楚。出于这个原因，目前的标准治疗方法存在相当大的不良反应。在这项研究中，作者的目的是利用全外显子组测序（WES）来识别OS患者的基因改变，以寻找新的潜在的预后生物标志物和治疗靶点。

02 研究材料

在这项研究中，作者招募了年龄小于40岁的原发性高级别传统OS患者。在所有病例中，作者都在化疗前对活检材料进行了分析。在新辅助化疗和手术切除肿瘤后，对标本进行治疗引起的肿瘤坏死组织学评估。肿瘤坏死≥90%的患者被归为良好反应者（GRs），而肿瘤坏死＜90%的患者被归为不良反应者（PRs）

03 研究结果

• 患者特征

这项研究共纳入了 22 名患者，有三例患者的活检样本DNA质量不高或不足，导致难以进行WES检测。因此，最终纳入研究的患者人数为 19 人。他们的临床病理特征见表 1。

表1. 本研究中的患者特征（缩写：AWD=带病存活；NED=无疾病证据；DOD=疾病死亡；MAP=甲氨蝶呤、阿霉素和顺铂；MAPI=MAP加异环磷酰胺）。

患者接受AIEOP ISG/OS-2方案治疗，包括联合使用大剂量甲氨蝶呤（HDMtx）、阿霉素和顺铂进行新辅助化疗（MAP方案）。组织学反应差的患者接受了四个周期的大剂量异环磷酰胺（“MAPI方案”）和Mepact （mifamurtide）。总体而言，对手术标本中化疗引起的肿瘤坏死的评估显示，GR的患病率略高于PR（10 vs. 9），随访期为6~54个月（平均31.6个月）。6例患者发生转移（平均时间：25.9个月±15.5个月），1例患者在17个月后局部复发，4名患者（21%）死于疾病。

• 基因组改变的景观

作者成功地对19个治疗前的肿瘤组织样本进行了WES。经过几个预处理和筛选步骤，共鉴定出52701个体细胞单核苷酸变体（SNV），其中包括38123个错义、1567个无义和1912个somatic indels。

通过使用MafTools分析，作者可以按类型、蛋白质影响和单核苷酸变异类别（SNV类别）对驱动基因的突变进行分层。作者还强调了“顶级突变基因”和各组之间单个基因突变频率的差异。

图1总结了样本中的变异。最常见的遗传变异是错义突变，最常见的变异类型是单核苷酸多态性（SNPs），其中C>T是最常见的单核苷酸变异。OS21 基因突变数量最多（n = 478）（图 1），最常发生突变的基因是 RPTN（19 例患者中有 14 例发生突变），其次是 KMT2C、BAGE 和 NOTCH3（11/19）。作者在 8 个样本（42.1%）中发现了BRCA2突变，而 4 个OS出现了 BRCA1突变。BRCA2变异主要是错义突变，其次是多义和无义突变，而所有 BRCA1变异都是错义突变。有趣的是，携带BRCA2突变的肿瘤比野生型OS有显著更高的肿瘤突变负荷（TMB）。

图1. OS 组群的突变图谱分析。

• 不同治疗反应的OS患者的基因组特征

为了根据治疗反应来描述OS群体，作者首先将总生存时间和无进展生存期（PFS）与治疗反应相关联（图2a，b）。良好反应者（GR）的存活率高于不良反应者（PR），即使这种差异并不显著。然而，与治疗反应差的患者相比，治疗反应良好是PFS的一个具有统计学意义的积极预后因素（p=0.002）。

此外，GR组和PR组的DNA拷贝数改变（CNA）分析显示（图2d），与GR组相比，PR组中插入/缺失的发生率略高。特别是，PR组12号染色体（增加）和18号染色体（丢失）的改变百分比明显高于GR组（chr12：5/9 vs.0/10；chr18：6/9 vs.2/10）。CNA在两组间无显著差异，在肿瘤突变负荷方面也无显著差异（图2c）。

与 GR 组相比，PR 组中某些基因的突变频率更高，图 3a 显示了这一点。特别是在 PR 患者中，BRCA2、RB1、RAD50、ARID1A、ARID1B 和 CREBBP 基因突变的发生率较高。在 GR 和 PR 之间也发现了最常见突变基因的差异，GR组RPTN（80%）、BAGE（70%）、POLD1（70%）和PORCN（70%）有改变，PR组CREBBP（78%）、KMT2C（67%）、ARID1A（78%）和BRCA2（56%）有改变（图S1）。

使用成对的Fisher精确检验，作者还分析了两组中最频繁突变的基因之间的体细胞相互作用，两者都具有共现性和互斥性。在GR组中，作者发现某些基因与ATRX显著共存，其在OS中的作用尚未明确（图S2A）。与此相反，从对PR分析中得到的一个显著发现是，已经被描述为在OS中发生改变的基因，如 BRCA2、RB1、NOTCH3 和 PARP4也经常参与其中。在某些情况下，基因突变存在很强的共现性（例如PARP4 和 RAD50之间），而 NOTCH3 和 KMT2B 基因突变则是互斥的（图 S2B）。

图2. 良好反应和不良反应患者OS的分子特征。

图3. OS患者中最常见的基因突变。

• 疾病状态下OS的基因组特征

在遗传方面，对PFS间隔产生负面影响的因素是BRCA2 （p = 0.04）、ARID1A （p = 0.002）、CREBBP （p = 0.003）和RAD50 （p = 0.002）基因的突变（图3b-e），即使这些突变不影响总生存时间。然后作者比较了具有BRCA1或BRCA2突变的肿瘤患者和具有野生型OS的患者的PFS时间，作者观察到具有BRCA1/2突变的OS组的PFS时间显著较低（p=0.02，log-ranch检验）。总体而言，作者确定了17个突变基因，将无疾病进展的患者与存活或死于疾病的患者区分开来（图4a，b），这些基因以前未涉及OS的生物学。

然后，作者研究了肿瘤突变负荷（TMB）与预后的相关性。GR和PR的TMB中值分别为33.6/MB（最小-最大：6.3-183.0）和39.2/MB（最小-最大：23.7-247.7），即使这一差异在统计学上不显著（图2c）。然而，当作者用中位数和第75个百分位数划分高TMB和低TMB的OS群组时，出现了一些相关的差异。具体而言，以第 75 百分位数为分界点，低 TMB 患者的 PFS 和总生存时间明显更高，而以中位数为分界点，PFS的差异处于临界值，而总生存时间则不存在差异。

此外，在最后一次随访中，没有转移的OS患者（n=12）比发生转移的OS患者（n=7）的生存概率更高，即使这种差异没有达到统计学意义（图4c）。同时还研究了TMB与转移存在的相关性（图4d），作者发现了25个区分转移患者和非转移患者的突变基因（图4e，f），这些基因以前都没有被发现与OS的进展或预后有关。转移性（中位数：37/MB；最小-最大值：22-243/MB）和非转移性患者（中位数：29/MB；最小-最大值：6-180/MB）的 TMB 中位数差异并不显著。

图4. 根据疾病进展的OS的基因组特征。

在这项研究中，作者进行了WES分析，以确定 OS 中与肿瘤进展、转移发展和细胞毒性治疗耐药性有关的临床相关基因改变。这些生物标志物对于早期预后评估至关重要，并为患有携带这些突变的肿瘤的受试者提供更具体的治疗。由于多项研究表明，携带 RAD50、BRCA 和 RB1 突变的肿瘤对聚 ADP 核糖聚合酶（PARP）的药理学抑制剂敏感，因此存在这些突变的肿瘤患者可能会受益于个性化靶向治疗，另一方面，具有与更好预后相关的突变特征的肿瘤患者可以避免导致多种副作用的大量非特异性治疗。当然有必要进行进一步的研究来阐明 TMB 与生存之间的关系，这可能导致使用 TMB 作为预测OS患者预后的标志物。

原文链接：https://www.mdpi.com/1422-0067/24/12/10086

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