Nature genetics | 高通量单细胞ChIP-seq识别乳腺癌染色质状态的异质性

组蛋白修饰调节染色质结构是一种主要的表观遗传机制和基因表达的调控机制。单细胞测序是近几年热点方向，它可以用于解析细胞异质性。然而，目前研究主要是从mRNA角度去研究，染色质特征对细胞异质性的影响仍然不太清楚。组织层面通常是利用bulk ChIP-seq去表征组蛋白修饰的全基因组图谱，但这将掩盖单细胞水平的特异性信息。那么，利用单细胞ChIP-seq解析染色质特征对肿瘤异质性的影响研究如何开展，看看今天我们带来的一篇单细胞ChIP-seq文章。

发表单位：HiFiBiO SAS

期    刊：Nature genetics（IF:30.8）

发表日期：2019年5月31日

2019年HiFiBiO SAS的Annabelle Gérard 研究团队在期刊Nature genetics（IF:30.8）发表了题为“High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer”的研究论文。该研究介绍了单细胞ChIP-seq工作流程和细胞分类的准确性，以及识别了乳腺癌染色质状态的异质性。

01 研究背景

对化疗和靶向治疗产生耐药性是癌症治疗的重大挑战。深度测序和单细胞方法表明未经治疗的肿瘤内的遗传异质性是肿瘤耐药性的关键因素。但尚未发现驱动耐药性的遗传机制。该研究开发了scChIP-seq方法，可进行复杂生物系统中染色质状态异质性研究。该研究通过对H3K4me3和H3K27me3染色质状态的单细胞水平表征，在药物敏感肿瘤中鉴定出新的细胞，其具有与耐药细胞相同的H3K27me3染色质景观。

02 技术路线

03 研究结果

1. scChIP-seq液滴微流控工作流程。

作者结合微流控技术和单细胞DNA条形码技术，进行高通量scChIP-seq流程方法开发（图1.a）。该方法流程包含（1）Single-cell封装（2）Barcoded beads封装（3）细胞滴液和beads融合（4）滴液免疫沉淀（5）文库制备和测序。小鼠和人细胞系混合后的scChIP-seq结果表明97%的条形码明确地分配给单个物种。

2. 体外单细胞染色质景观检测

为了验证scChIP-seq技术的效率和准确性。作者从H3K4me3（促进转录）和H3K27me3（抑制转录）修饰的单细胞分布中进行细胞身份概括。实验使用人Ramos（B细胞）和Jurkat（T细胞）进行scChIP-seq后，发现单细胞染色质谱和共识聚类明确了每个细胞系的2个稳定簇，H3K4me3和H3K27me3谱的细胞身份匹配特异性分别超过99.7%和99.5%，聚集的单细胞图谱以高精度重现了bulk ChIP-seq 图谱（图1.b-d）。此外，scChIP-seq差异分析鉴定Ramos和Jurkat细胞特有的激活和抑制染色质特征。聚焦于转录起始位点（TSSs）周围累积的H3K4me3，其结果表明鉴定出的一致的谱系特异性基因组群，在每个细胞系特有的染色质特征中富集。

这些结果表明，scChIP-seq是一种在单细胞水平检测染色质特征，根据其染色质景观对单细胞进行高精度分类以及识别细胞群体之间的区别染色质特征的稳健方法。

图1.单细胞ChIP-seq图谱重建细胞类型特异性染色质状态。

3. 体内基质细胞中H3K27me3结构的多样性

作者移植三阴性乳腺瘤到小鼠体内，构建对卡培他滨敏感（HBCx-95）和耐药（HBCx-95-CapaR）的小鼠模型（图2.a）。分别进行scChIP-seq、Bulk CHIP-seq和scRNA-seq检测。在单细胞分辨率下进行H3K27me3图谱检测和异质性分析。

scChIP-seq结果表明，无论是在敏感还是耐药性肿瘤中，共识聚类表明基质细胞根据H3K27me3谱稳定的分为Chrom_c1、Chrom_c2和Chrom_c3群体。组间染色质特征比较表明Chrom_c2和Chrom_c3中特异性富集H3K27me3位点。

scRNA-seq则鉴定出4个基质细胞群（图2.c）：2组成纤维细胞来源细胞（Col12a1、Efemp1），内皮细胞（Pecam1），巨噬细胞（Ms4a7）。

为了进一步比较两种方法鉴定出的细胞群体身份。作者对scChIP-seq分类的特异性染色质特征TSS基因（1kb内）进行H3K27me3位点分析。scChIP-seq和scRNA-seq数据表明，中Chrom_c2中Ptk2的H3K27me3信号缺失，在转录组水平上呈现Ptk2水平的上调（成纤维细胞标志物），这表明Chrom_c2与上皮间质转化过程密切相关（图2.d）。此外，Chrom_c3中Lrmp的 H3K27me3缺失，在转录组上呈现Lrmp表达水平的上调，这表明Chrom_c2在免疫表达程序中表达（图2.e）。此外，Chrom_c1中存在少数染色质标记特征相关基因无法识别，这表明要么scChIP-seq程序捕获这些细胞的效率较低，要么表明该细胞簇与Chrom_c2和Chrom_c3共享染色质特征。事实证明Chrom_c1簇中的一半细胞与免疫样细胞共享Ptk2的H3K27me3富集。

综上所述，scChIP-seq方法揭示了小鼠基质细胞中存在三种H3K27me3染色质景观，其中两种与scRNA-seq鉴定的转录组特征（成纤维细胞和免疫样特征）相匹配。

图2.小鼠基质细胞单细胞ChIP-seq分析揭示H3K27me3染色质景观的细胞身份。

4. 乳腺肿瘤中染色质结构的异质性

研究来自同一对三阴性乳腺肿瘤样本的细胞之间染色质普的异质性。基于染色质和转录组谱，细胞根据其敏感或耐药的肿瘤来源聚集（图3.a-c）。scChIP-seq数据表明，敏感细胞的染色质普较为均一，但耐药细胞群体呈现出不同的染色质状态，这表明出现了具有不同染色质特征的异质耐药细胞群体（图3.a）。此外，共识聚类表明未经治疗的肿瘤的3%的细胞（484例中 n = 13）与耐药细胞分类在一起，这表明它们具有共同的染色质特征（图3.d）。

与Chrom_c1的敏感细胞相比，Chrom_c2中耐药样细胞和耐药细胞表现出大量的 H3K27me3位点缺失（图3.e和f）。scRNA-seq数据表明有34个基因在两种细胞群中有区别，其中在Chrom_c2中变化2倍的基因包括上调基因DMKN，PDE4A，COL4A2，TMEM176B，IGF2bp3和下调基因C1orf21（图3.f）。此外，促进化疗耐药的基因IGF2BP3（图3.g）和上皮间质转化基因（图3.h和i；COL4A2, HOXD），其H3K27me3在Chrom_c2中表达缺失，而在转录组水平高表达（图3.g-i），诱导化疗耐药。

图3. 卡培他滨治疗三阴性乳腺癌PDX模型的敏感和耐药特异性H3K27me3染色质景观。

5. 未治疗肿瘤中“耐药样”染色质亚克隆检测

作者移植雌激素受体阳性乳腺瘤到小鼠体内，构建对他莫昔芬敏感（HBCx-22）和耐药性（HBCx-95-TamR）的小鼠模型。scChIP-seq结果表明，肿瘤细胞表现出两种与肿瘤来源相关的主要染色质谱（图4.a）。但是，敏感肿瘤内16%（41/255）的细胞与所有耐药细胞具有相同的染色质特征（图4.b和c）。因此，在来自敏感肿瘤的罕见细胞中发现耐药细胞的染色质特征。

染色质特征差异分析表示耐药样细胞和耐药细胞主要失去H3K27me3标记。Chrom_c2细胞中特异性缺乏H3K27me3的位点的基因在Polycomb复合体的基因靶点和乳腺上皮基底样特征基因中富集。scRNA-seq数据中只检测到2%的差异富集窗口的转录，在一部分耐药细胞中，这些基因H3K27me3信号丧失，显示转录激活：EGFR，IGFBP3，ALCAM（图4.d）。

scChIP-seq数据中，他莫昔芬耐药基因（EGFR）的H3K27me3位点在Chrom_c1和Chrom_c2富集；敏感肿瘤细胞群中EGFR中H3K27me3在Chrom_c1中占比44/212，Chrom_c2中占比3/43，而耐药细胞群中仅在Chrom_c2中富集；敏感肿瘤细胞群中EGFR转录表达水平在RNA_c1，RNA_c2，RNA_c3，RNA_c4中下调，在RNA_c6中呈现与耐药肿瘤细胞群中相似的上调结果（图4.h）。基因IGFBP3也具有相似表达模式（图4.i）。

scRNA-seq分析在敏感和耐药肿瘤中发现了7个簇（图4.e和f）。虽然来自敏感和耐药的细胞没有聚集在一起，但是对scRNA-seq数据进行差异基因检测和分类发现敏感肿瘤的RNA_c6簇细胞显示出耐药肿瘤细胞特征通路的激活，该通路包含基底样基因特征和上皮-间质转化特征（图4.g）。

因此，两种测序技术平行比对检测出敏感细胞中耐药样细胞群体。scChIP-seq数据更直观展示出敏感细胞向耐药细胞的转变过程。

图4. 在接受他莫昔芬治疗的雌激素受体阳性PDX模型中，敏感肿瘤部分细胞与耐药细胞共享H3K27me3染色质特征。

作者开发了单细胞ChIP-seq方法，该方法高精度地揭示单细胞染色质景观中的细胞身份，并识别单细胞组之间的区别性染色质特征。在乳腺癌PDX样本中证明基质细胞和肿瘤细胞群内染色质景观的多样性。并且，敏感和耐药PDX的scChIP-seq发现未经治疗的药物敏感肿瘤中的一小部分细胞显示出与耐药细胞相同的H3K27me3染色质景观，揭示了染色质特征水平上肿瘤异质性。因此，scChIP-seq是一种在单细胞水平检测染色质特征，可以探测复杂生物系统中染色质状态的异质性和动力学的作用。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41588-019-0424-9

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