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DNA甲基化与转录组关联不上？看看这篇文章DNA甲基化往往在认知上被赋予与基因表达抑制相关的功能，但在实际测序结果中，可能会发现，为什么某些基因高甲基化环境与它的表达并不呈现相关性，难道是测序有问题吗？其实并不尽然，这篇来自Acta Pharm Sin B的文章或许能为您提供一些新的思路。动态遗传和非遗传变异改变的积累破坏了癌基因和肿瘤抑制基因（TSGs）表达之间的平衡，导致了肿瘤内异质性（ITH），其中非小细胞肺癌的ITH阻碍了基于生物标志物的个性化治疗干预和早期诊断的发展。蛋白酶丝氨酸3（PRSS3，具有四个剪接变体（PRSS3-SV；PRSS3V1-V4））作为一种很有前景的癌症生物标志物和候选药物靶点，在癌症发展中却表现出矛盾的作用，即作为癌基因促进肿瘤转移和复发，或作为抑癌基因抑制肿瘤生长。为此，一篇来自首都医科大学附属北京胸科医院肿瘤研究中心/北京交通大学黄家强团队发表的文章《UHRF1/DNMT1eMZF1 axis-modulated intragenic site-specific CpGI methylation confers divergent expression and opposing functions of PRSS3 isoforms in lung cancer》对PRSS3不同转录本对肿瘤的调控机制进行了研究，发现了存在于其中的DNA甲基化—转录因子—PRSS3不同转录本—肿瘤发育调控的研究机制（UHRF1/DNMT1-MZF1轴），为肺癌的早期检测和靶向治疗提供了帮助。
1.1 PRSS3转录本在肺癌中有发散性表达无论是肺癌细胞系还是LUAD肿瘤组织，PRSS3的表达存在差异，定义为PRSS3 Low（71%）和PRSS3 High（29%）。其中PRSS3-V2和PRSS3-V1（PRSS3-V1/V2）是PRSS3在PRSS3 High和PRSS3 Low肺癌细胞中表达的主要转录本（图1A-E）；而PRSS3-V3/V4的表达明显低于匹配的邻近组织或正常细胞。因此，PRSS3 mRNA的异常表达是PRSS3转录本在肺癌中表达分化的结果。 抗pan PRSS3（PRSS3-V1到PRSS3-V4亚型）抗体的Western blot结果显示，肺癌细胞裂解物中主要为PRSS3-V1和PRSS3-V2（图1F）；抗PRSS3亚型和细胞角蛋白（CK）（一种癌症特异性蛋白）的抗体的多重免疫组化（mIHC）表明PRSS3-V1/V2和PRSS3-V4定位于CK阳性（CK+）组织区域，而PRSS3-V3定位于CK阴性（CK-）组织区域（图1I-J）。 这些结果表明，PRSS3转录本（PRSS3- V1 /V2High和PRSS3- V3low）在转录水平和蛋白表达水平上存在差异，表明它们在功能上存在差异。
图1：PRSS3转录本在人肺癌中的差异表达 1.2 PRSS3转录本在肺癌患者中显示出与临床相关的独特细胞功能为了评估PRSS3-SVs在肺癌中的功能作用，作者通过CRISPR/Cas9基因组编辑将PRSS3从PRSS3High A549和801-D细胞中删除，同时用PRSS3-V1-V4 cDNA稳定转染PRSS3Low NCI-H460和NCI-H1299细胞。PRSS3缺失显著降低了A549和801-D细胞的增殖和迁移能力（图2A），而PRSS3-SVs的异位表达导致了NCI-H460和NCI-H1299细胞的双重作用，包括致瘤性PRSS3-V1/V2和抗肿瘤性PRSS3-V3（图2B）。 裸鼠成瘤实验也发现PRSS3-V3过表达导致NCI-H460细胞形成的异种移植物肿瘤体积显著减少，而PRSS3-V1/V2过表达显著促进异种移植物肿瘤生长（图2C）。这些结果表明，PRSS3-SVs在肺癌中的功能不同：致癌PRSS3-V1/V2，肿瘤抑制PRSS3-V3和无功能PRSS3-V4。此外，Tissue Array队列的临床关联研究和KaplaneMeier生存分析也显示PRSS3-V1/V2high的患者存活率更低，肿瘤侵袭更严重；而PRSS3-V3High与良好的预后相关（表1）。 PRSS3潜在靶向下游基因分析发现，MUC13与PRSS3-V1，F2RL1（PAR2）和PRSS3-V2，CFTR/REG1A和PRSS3-V3在mRNA和蛋白质水平上都存在特定的关联（图2D-E）。kaplan-Meier生存分析显示，在TCGA队列中，MUC13-High或F2RL1-High的LUAD患者的OS明显较差，而CFTR-High或REG1A-High的LUAD患者的OS较好（n=502），这表明PRSS3转录本通过靶向不同的分子途径赋予了不同的功能结局。
图2：异位PRSS3转录本对肺癌细胞的恶性肿瘤和致瘤性的双重作用 综上所述，这些发现表明，PRSS3转录本的不同表达具有双重细胞功能，即PRSS3-V1/V2的致癌功能和PRSS3-V3的抑瘤功能，并基于不同的下游靶基因具有相关的临床相关性。因此，这些转录本有助于癌症进展过程中的功能异质性。 2.1 肺癌中CpG甲基化差异调控PRSS3转录物PRSS3甲基化发生在6个CpG位点，分布在cTSS从-170到34,654 nt的广泛基因组区域（定义为CpG位点A到F）（图3A）。其中PRSS3基因上游偏向于高甲基化，而基因本体区的甲基化动态变化较大。随后，对比分析显示，肺癌细胞系中PRSS3的表达与PRSS3的三种CpGIs（CpGI_1-3）的甲基化呈负相关。但PRSS3-SVs的表达与CpGI甲基化存在差异，不同的SV与不同的CpGI有关（MSP-qPCR和MassArray实验验证，图3B-G）。此外，去甲基化剂5-Aza-CdR能够调控PRSS3-SVs的差异表达（图3H-J）。这些结果证实了肺癌中iCpGI的动态和差异甲基化，可能特异性调节了PRSS3转录本的表达。
图3：肺癌细胞中差异CpG甲基化与PRSS3转录表达相关 2.2 UHRF1相关的DNMT1复合体控制PRSS3 iCpGI甲基化qPCR结果显示，DNMT1、DNMT3A以及DNMT3B（三种甲基化修饰酶）均在肺癌相关细胞中表达（图4A）。而MeDIP-qPCR（图4B和C）和ChIP-qPCR（图4G-H）结果表明DNMT1通过特异性靶向iCpGI（intragenic CpG）介导了PRSS3甲基化，并且与UHRF1相互作用，靶向iCpGIm调控PRSS3的表达（PRSS3- V1 /V3的表达降低，而PRSS3- V2的表达增加；I-K）。
图4：UHRF1/DNMT1复合物对PRSS3转录本的调控 2.3 UHRF1/DNMT1阻碍MZF1锚定到PRSS3 iCpGI为了确定UHRF1/DNMT1锚定iCpGI如何调节PRSS3转录物的差异表达，作者预测了可能结合PRSS3的转录因子。在cTSS从-1000 nt到1000 nt的2 kb序列中，位于iCpGI中得分最高的4个富含GC的共识序列被鉴定为结合髓系锌指1（MZF1）的基序位点，命名为Motifs_1至_4。它们都接近或位于PRSS3 iCpGI内（图5A）。MZF1通过其c端锌指结构域结合靶基因中富含GC的一致序列发挥转录调控活性。其中MZF1-V1和MZF1-V2编码的是完全异构体1（MZF1L），而MZF1-V3编码的是C端截断异构体2（MZF1S）。功能未知的MZF1S缺乏锌指结构域，可能作为MZF1的“诱饵”突变体（图5B）。考虑到锌指蛋白优先结合富含GC的基序，作者假设MZF1是一种甲基敏感的转录因子，通过UHRF1/DNMT1调控的甲基化参与了PRSS3转录物的表观遗传调控。 因此，作者通过建立MZF1KO+V A549细胞模型来检测MZF1对PRSS3转录本表达的影响，在该模型中，通过CRISPR/Cas9删除内源性MZF1转录本，然后转染含有MZF1L（MZF1-V2，MZF1KO+L）或MZF1S（MZF1-V3，MZF1KO+S）的构建体（图5C-F）。为了验证MZF1的特异性结合，作者克隆了包含不同MZF1结合基序的4个DNA片段（从包含所有4个基序的FA到仅包含motif_4的FD），并与PRSS3-V1或PRSS3-V3共转染到PRSS3Low NCIH460细胞中。研究发现转染含有两到三个基序片段的细胞中荧光素酶活性增加，并且最依赖于motif_3（图5G）。ChIP-qPCR分析显示，在过表达MZF1KO+L而不表达MZF1KO+S的细胞中，抗MZF1抗体富集的iCpGI片段增加（图5H），证实了MZF1通过其c端锌指结构域特异性结合iCpGI。免疫荧光染色结果显示DNMT1抑制MZF1的核共定位（图5I），ChIP实验进一步显示DNMT1在过表达DNMT1的A549细胞和缺失DNMT1的NCI-H460细胞中抑制MZF1与iCpGI的结合（图5J）。 考虑到位于iCpGI中的MZF1基序，这些结果表明CpG位点甲基化状态在MZF1靶向其基序的可及性中起重要作用。这些结果揭示了UHRF1/ DNMT1介导的位点特异性iCpGI超甲基化阻碍MZF1锚定在其基序上，从而特异性调节肺癌细胞中PRSS3转录本的差异表达的表观遗传机制。因此，这一途径被称为UHRF1/DNMT1-MZF1轴。
图5：UHRF1/DNMT1对MZF1锚定到PRSS3 iCpGI的影响 2.4 UHRF1/DNMT1-MZF1轴支持表观遗传调控剂对肺癌细胞的抗癌作用大蒜衍生的化合物二烯丙基三硫醚（DATS）作为一种表观遗传调节剂，能够调节MZF1的表达以发挥其抗癌活性。DATS处理的A549细胞模型（PRSS3转录本共表达）结果表明，与较低剂量（12.5和25 mmol/L）相比，较高剂量（50 mmol/L）的DATS对A549细胞的抗增殖和抗侵袭作用减弱（图6A），高剂量DATS增强UHRF1/DNMT1表达与在PRSS3 iCpGI的结合，但低浓度DATS诱导降低了iCpGm（图6C-E）。高剂量DATS处理的A549细胞中，异位PRSS3-V3、MZF1L以及5-Aza-CdR处理均能降低这种结合状态（图6F-I）。DATS能够与5Aza-CdR合作，通过UHRF1/DNMT1eMZF1轴特异性调节PRSS3的表达，具有表观遗传治疗潜力。
图6：DATS与5-Aza-CdR相互作用，通过位点特异性的iCpGI甲基化调控PRSS3的表达 作者在一组BALF标本中评估了iCpGIm对PRSS3转录本的影响。RT-qPCR分析显示，与LUSC样本中的PRSS3-V1High和LUAD样本中的PRSS3-V2High不同，LUAD或LUSC患者BALF样本中的PRSS3-V3表达明显低于慢性肺炎患者样本（图7A）。MSP-qPCR分析显示，72%的LUAD样本（25个样本中的18个）是高甲基化的，而所有来自慢性肺炎（15/15）或LUSC（14/14）患者的样本都是低甲基化的（图7B，表2）。重要的是，iCpGIm与LUAD （P < 0.001）和早期肺癌侵袭深度（P Z 0.047）相关（表2）。尽管在BALF样本中显示了iCpGIm与PRSS3-SVs表达之间的关联差异（图7C），Spearman相关分析显示，与炎性BALF样本相比，LUSC和LUAD患者BALF样本中iCpGIm与PRSS3-V1和PRSS3-V3的表达显著相关（图7D）。重要的是，在LUAD患者的BALF标本中，iCpGI高甲基化与PRSS3-V3Low的相关性更为显著（图7C, D），这与PRSS3-V3在肺癌和组织中的表观遗传沉默一致（图3B, C）。
图7：BALF标本中iCpGI高甲基化与PRSS3-V3表达的关系 爱基百客专注于提供领先的表观组学服务，可提供方案设计、样本制备、测序、分析以及验证一站式服务。项目咨询请联系区域销售。 武汉爱基百客生物科技有限公司（简称爱基百客），位于武汉高农生物园，是一家专业提供表观组学科研服务、单细胞与空间组学测序分析和高通量测序分析的新型生物科技服务企业。公司先后引入ChIP、WGBS、ATAC-seq、全转录组、10x Genomics、DNBSEQ-T7等实验平台，不断提升公司的科研服务能力。 运营期间，爱基百客也获得政府与社会高度认可，先后荣获武汉市高新技术企业认定、国家ISO9001质量管理认证、技术开发合同优秀企业认定、武汉市千企万人认定、武汉市瞪羚企业认定等多项荣誉，并获得武汉市第十二批“3551光谷人才计划”支撑和光谷人才基金的投资。 运营至今合作的科研客户超2000家，涵盖国内知名科研院所、高校以及相关生物企业，科研成果曾多次在Cancer Cell、Nature Communications、J HEMATOL ONCOL、Plant Cell 等国际高水平学术期刊发表，受到了客户广泛好评，是国内成长最迅速的高通量测序科研服务企业之一。
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