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Plant Commun | 正交组、系统转录组和CUT-Tag发掘植物保守冷响应因子BBX29及其靶基因植物以固着的方式生活,但它们并不完全被动,许多温带植物通过预暴露于非冻结低温来增加它们的抗冻性,这种适应性过程被称为冷驯化(CA)。越来越多的证据表明,低温下的许多生理和代谢变化是由于CA诱导的冷反应(COR)基因的表达。C-重复结合因子(CBF)被认为是CA中获得耐冷性的主要调节因子,尽管已证实CBFs可以结合一千多种基因,但只有约10%-20%的COR基因受CBFs调控,表明多的转录因子(TFs)参与了耐冷性。在拟南芥中,转录因子HSFC1,ZAT12和CZF1被证明以非依赖CBF途径的方式调节低温反应。此外,CBF直向同源物在许多其他植物物种中对冷胁迫的分子响应也得到了很好的响应。然而,这些研究往往集中于一个或两个物种,且对冷反应分子机制的研究也局限于充分证明的CBF途径基因,忽视了跨物种甚至跨同种生态型的直系同源基因在低温中的不同响应,难以获得调节跨物种耐冷性的共同直向同源TFs。 2023年9月9日,浙江农林大学吴文武教授、黄华宏教授以及南方科技大学朱健康教授联合在Plant Communications上发表了题为“Orthogroup and phylotranscriptomic analyses identify transcription factors involved in plant cold response: a case study of Arabidopsis BBX29”的研究论文。研究对5个代表性的双子叶植物物种进行了正交组(orthogroup)和系统转录组(phylotranscriptomic)分析,确定了35个保守的冷反应转录因子正交组(CoCoFos)。从中选取了B-BOX结构域蛋白29(BBX29),通过表达和反向遗传学证实BBX29以CBF和ABA独立方式负调控拟南芥耐冷性,并结合CUT&Tag-seq和RNA-seq鉴定了BBX29直接靶向的137个COR基因。 1、双子叶植物中35种CoCoFos的鉴定 为了筛选跨植物的通用冷响应TFs,研究从不同的双子叶植物谱系中选择了五个物种(拟南芥、山核桃、大豆、白桦和毛果杨),使用OrthoFinder程序将它们的基因分为了10,549个正交组。结合冷应激前后[0,2,24,168h]的基因表达差异,进一步将正交组分成了6个类群(图1A)。类群1具有238个正交组,在5个物种中都显示出冷胁迫后上调的表达模式,其中35个为TF正交组,命名为CoCoFos,这包括AP2/ERF、WRKY、NAC、MYB、GLK、COL和bZIP等TF家族成员(图1B)。 图1. 双子叶植物中保守的冷反应转录因子正交组及其与CBFs相关的表达 2、少数CoCoFos的冷诱导依赖于CBFs 35个CoCoFos在拟南芥中对应112个TF基因,将它们与已报道的拟南芥CBFs调节的81个COR TFs进行比较分析,两者之间仅重叠17个基因(图1C),这代表着依赖于CBFs的冷响应调节网络。剩余95个拟南芥TFs以不依赖CBFs的方式受冷调节,其中包括已知的HSFC1、ZAT12和CZF1。GO富集显示这95个基因与核酸结合、转录调节子活性、基因表达的调节和对胁迫的反应有关(图1D)。这些结果说明大多数的CoCoFos与以不依赖CBFs的方式受到冷调节,并且存在许多未知的冷反应途径。 3、BBX29的冷诱导与CBFs无关 为了检验CoCoFos的有效性,作者从中选取了一个“非典型”胁迫相关TF家族,来自于BBX V正交组中的拟南芥BBX29,该基因参与调节光形态发生,受冷诱导,但在冷应激下的功能作用未知。除了拟南芥,BBX29共直系同源物在其他双子叶植物中也在冷诱导后上调(图2A),表现出保守的表达模式。基于CBF1/2/3的全基因组结合谱ChIP-seq和DAP-seq数据显示,CBF1/2/3不与BBX29结合;且BBX29在cbf123-1突变体和野生型(WT)中表现出相似的高度冷诱导模式(图2B、C)。这些实验数据表明,拟南芥BBX29的冷诱导不依赖于CBFs。 图2. BBX29冷诱导与CBFs和ABA无关 4、BBX29的冷诱导主要是非ABA依赖性的 先前的研究表明,许多冷相关基因是通过ABA信号转导被诱导的。从公开的转录组数据中分析ABA处理不同时间下的BBX29表达量,其呈现出相对较小的变化(图2D)。qRT-PCR实验也证实,与WT相比,BBX29在aba3(ABA缺陷型)和abi1(ABA不敏感型)突变体中的表达只在小范围内波动(图2E)。这也说明冷胁迫下BBX29的表达主要受ABA非依赖性途径的调节。 5、BBX29在抗冷性中的负作用 为了探索BBX29在冷胁迫下的功能,作者构建了35S::BBX29-Myc过表达(OE)系,并获得了bbx29突变体。正常条件下,OE系和bbx29突变体表现出与Col-0和cbf123-1相似的表型;在CA的冷冻条件下,cbf123-1表现出复合预期的超敏表型;相比之下,在有或没有CA的冷冻条件下,两个独立的bbx29突变体表现出抗冻性增加,而两个独立的BBX29-OE系表现出超敏表型(图3A)。bbx29突变体的存活率最高,其次是Col-0和OE系(图3B)。一致地,OE系的电解质渗漏明显高于Col-0,而bbx29突变体表现出明显较低的离子渗漏(图3C)。这些发现表明BBX29在耐冷性中起负作用。 图3. BBX29负调控拟南芥的耐冷性 6、BBX29调控数千个冷反应基因 为了确定冷应激下BBX29的分子作用,研究进行了冷应激下Col-0、35S::BBX29-Myc(OE5)和bbx29-2的RNA-seq实验。根据在Col-0中受到冷诱导或冷抑制,以及在过表达或突变BBX29后上调或下调这两个条件,鉴定了1,547个受BBX29调控的COR基因(图4A),模糊c均值聚类方法显示这些基因在三个生态型样本间有10个不同表达模式的簇(图4B)。GO富集分析显示这些受BBX29调控的基因如预期般的富集在光相关的类别中,除此外还富集与应激和/或激素相关的类别,包括对寒冷、温度应激、ABA、JA和SA的响应(图4C)。这些发现表明,BBX29可以调节参与许多生物过程的基因,包括对光、温度变化和激素的反应。 图4. 超过一千种COR基因受BBX29调控 7、BBX29结合的全基因组位点和基序 为了确定由BBX29直接调控的基因,作者在35S::BBX29-Myc上进行了CUT&Tag-seq实验,以鉴定拟南芥基因组中BBX29的结合谱。一共在994个基因中获得了1,093个结合峰,超过80%的这些结合峰位于拟南芥基因的启动子区域(< 2kb)(图5A),几个结合峰CUT&Tag-qPCR结果的显著富集证实了CUT&Tag-seq的可靠性(图5B)。此外,对BBX29结合峰周围序列的基序富集分析,发现了两个显著富集的motif,一个是众所周知的与B-box结构域蛋白结合的G-box元件,另一个是一个新的包含G-box一半的核心GTG的motif(图5C)。这些观察表明,BBX29可能通过识别靶基因启动子中的G-box和/或相关元件来调节基因表达。 图5. BBX29的全基因组结合谱及其直接COR靶标 8、BBX29直接靶向137个COR基因 如上所述,拟南芥中1,547个COR基因受到BBX29过表达或功能丧失的显着影响,而994个基因中的1,093个位点似乎受BBX29结合。综合这些结果,确定了137个直接被BBX29靶向的COR基因(图5D)。GO富集分析表明,这些基因在应对非生物胁迫时显著富集,如冷、热、水、盐、缺氧、激素和光刺激(图5E)。研究结果表明,BBX29可以直接与COR基因结合,并调节其表达。 9、BBX29调节主要独立于CBFs的COR基因的表达 虽然BBX29的冷诱导不依赖CBFs和ABA信号,但冷诱导后,BBX29仍有可能与CBFs或ABA信号共同调节COR基因的表达。为了确定这种可能性,研究首先从以前的研究中获得了146个CBFs靶向的COR基因和3,060个ABA应答基因,然后结合本研究中的转录组数据,获得了1,217个差异表达的ABA应答COR基因。对三个基因集进行比较分析,发现半数CBFs靶向CORs也受ABA信号调节,这与先前的研究一致;有趣的是,近40%的BBX29靶向CORs也受ABA信号调节,但只有7个(< 5%) BBX29靶向CORs与CBFs靶向CORs重叠(图6A)。这些发现表明BBX29主要独立于CBF途径调节COR基因。 图6. BBX29主要通过不依赖CBFs的途径调节冷反应 10、BBX29直接调节一组COR-TF基因 通过检查BBX29靶向的COR基因,研究发现了一些与寒冷和/或其他非生物胁迫反应有关的被充分证明的TFs。例如ZAT12是与CBFs平行冷诱导的锌指TF,其过表达增加抗冻性;PRR9是拟南芥生物钟系统中温度响应性的组成部分;RVE1是一个调节抗冻性的Myb家族TF;MYB96可以整合ABA和冷信号激活CBF-COR途径。这些COR TFs的基因座上具有BBX29结合峰,并且在BBX29过表达后它们的表达降低(图6B)。此外,WT和cbfs样品的RNA-seq分析证实了这些COR TFs的表达不依赖于CBFs(图6B)。总之,这些结果说明BBX29通过抑制一组主要独立于CBFs的COR TF基因在耐冷性的负反馈环中发挥作用。 总之,这项研究通过正交组和系统转录组分析鉴定了5种双子叶植物中的35个冷响应保守CoCoFos,并以拟南芥BBX29为例证实了CoCoFos的有效性。BBX29主要通过CBFs非依赖性途径调节耐冷性。此外,通过详细检查BBX29靶基因,还发现它们也参与植物对其他非生物胁迫(盐、渗透和伤害)、光(蓝色和红色)、激素(SA、JA和CK)和其他信号的反应(图7)。因此,BBX29可以作为多种信号途径的重要整合者,包括外部环境线索(光和非生物胁迫)以及内部激素信号,以调节植物的胁迫耐受性、生长和发育。 图7. 双子叶植物中的35个CoCoFos和拟南芥中BBX29靶向COR基因的功能类别 爱基百客专注于提供领先表观组学服务。公司先后引入ChIP、CUT&Tag、WGBS、ATAC-seq、全转录组、10x Genomics、DNBSEQ-T7等实验平台,不断提升公司的科研服务能力。至今合作的科研客户超2000家,涵盖国内知名科研院所、高校以及相关生物企业,科研成果曾多次在Cancer Cell、Nature Communications、J HEMATOL ONCOL、Plant Cell 等国际高水平学术期刊发表,受到了客户广泛好评,是国内成长最迅速的高通量测序科研服务企业之一。 了 解 更 多 { 往 期 精 彩 回 顾 } 精选合集,欢迎收藏哟! |