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Molecular Plant | ChIP-seq+RNA-seq解析E2F转录因子在植物复制胁迫响应中的独特和互补作用生物体的生存完全依赖于它们对基因组完整性的维持,而基因组完整性受到增殖细胞复制胁迫的永久威胁。尽管植物DNA损伤反应(DDR)调节因子SOG1已被证明能够应对复制缺陷,但越来越多的证据表明,还有其他途径独立于SOG1发挥作用。 2023年7月5日,巴黎萨克雷大学的Cécile Raynaud研究团队在 Molecular Plant期刊发表了题为“Distinctive and complementary roles of E2F transcription factors during plant replication stress responses”的研究论文。该研究揭示了拟南芥E2FA和E2FB转录因子在DNA复制胁迫响应中的作用。 研究单位:法国巴黎萨克雷大学 发表时间:2023年7月5日 发表杂志:Molecular Plant (IF:27.5) 研究技术:TChAP、ChIP-seq、RNA-seq 研究背景 在所有真核生物中,遗传信息从一代到下一代的忠实传递在很大程度上依赖于准确的DNA复制。一些因素,包括嘧啶二聚体,未修复的DNA损伤,RNA-DNA杂交和DNA二级结构的形成,可以破坏或减缓DNA复制。这些因素可能导致分叉停滞,导致复制胁迫,进而影响基因组完整性。 研究思路 研究结果 1. E2FA 和 E2FB 与 SOG1 共享靶标 E2FA、E2FB和RBR1最近都被证明在植物的DNA双链断裂(DSB)反应中发挥作用。利用最近对E2FA和E2FB靶标的分析,作者研究了E2FA/B是否与SOG1有共同的靶标。 通过串联染色质亲和纯化(TChAP)或染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)实验确定的E2FA、E2FB和SOG1的靶基因时,作者发现,与偶然预期相比,两个E2F转录因子中的至少一个也靶向了更多的SOG1靶基因(图1A)。其中,WEE1基因编码一种参与复制胁迫反应的细胞周期抑制激酶。有趣的是,在sog1突变体中,在羟基尿素(HU)诱导的复制胁迫反应中观察到WEE1启动子的残余激活,并且在其启动子中发现E2F结合位点,这证实了E2FA/B可能参与复制胁迫反应。 接下来,作者将实验确定的E2FA和E2FB结合位点的位置与之前确定的SOG1结合位点的位置进行了比较。E2FA和E2FB均在靠近SOG1结合位点的位置结合共同靶基因(图1B-E),表明E2FA/B和SOG1在其靶启动子上彼此紧密结合。观察到E2FA/B可以独立于SOG1激活WEE1以响应HU,并且推测的E2FA/B和SOG1靶基因之间的显著重叠(图1A)促使作者检验E2FA/B是否在复制胁迫反应中发挥作用。 图1. E2FA、E2FB和SOG1具有共同的靶基因 2. E2FB的缺失严重加剧了由复制胁迫引发的生长缺陷 为了探索E2FA和E2FB在复制胁迫反应中的作用,作者使用了表现出组成型复制胁迫的DNA聚合酶ε(Polε)的亚型突变体pol2a-4(以下简称pol2a),并在pol2a、sog1和e2fa或e2fb突变体之间产生双重突变体和三重突变体组合。E2FA和E2FB都有两个独立的T-DNA插入系。就E2FA而言,e2fa-1等位基因似乎是一个缺乏E2FA蛋白积累的无效突变体,而e2fa-2则积累了大量截短蛋白。就E2FB而言,在e2fb-1或e2fb-2突变体的蛋白提取物中均检测不到该蛋白。在蛋白质功能方面,利用e2fa-2而非e2fa1等位基因获得了可存活的的e2fa e2fb双突变体,这表明在e2fa-2突变体中积累的截短蛋白质至少具有部分功能。因此,在遗传分析中,作者只使用了e2fa1突变等位基因(其中E2FA可能完全丧失功能)和e2fb两个等位基因。 表型上,与野生型(Col0)相比,e2fa-1和e2fb-1单突变体没有表现出生长减少,而pol2a突变体明显较小(图2A,B),pol2a sog1双突变体的生长减少更为严重,与sog1突变体对复制胁迫的超敏感性一致,pol2a e2fa-1突变体的莲座大小与pol2a亲本相同,而e2fb-1 pol2a突变体的莲座略小。值得注意的是,e2fb-1 pol2a sog1三突变体比pol2a sog1表现出更严重的生长缺陷,而e2fa-1突变体没有观察到这种现象(图2A,B)。作者还分析了各种突变体的根长,并观察到E2FB,而非E2FA,是遭受组成性复制胁迫的植物根系生长所必需的(图2C),特别是在SOG1缺失的情况下。这些数据表明,E2FB有助于植物对复制胁迫的反应,尽管存在复制缺陷,但仍能维持生长。 图2. E2FB,而非E2FA是植物持续生长所必需的,以响应复制胁迫 3. E2FB正向调节分生组织大小和细胞周期进程以响应复制胁迫 在e2fb-1 pol2a sog1三重突变体中观察到的严重生长抑制,以及在e2fb-1 pol2a双突变体中的较小程度的生长抑制,可能是由于细胞增殖缺陷所致。为了验证这一假设,作者首先测量了所有基因型的根分生组织的大小。如图3所示,Polε缺失引发的复制胁迫导致分生组织大小减小。虽然这一缺陷在SOG1缺失的情况下并没有显著加剧,但在ef2b-1 pol2a和e2fb-1 pol2a sog1突变体中,根分生组织长度进一步缩短(图3B)。同样,在e2fa-1 pol2a和e2fa-1 pol2a sog1突变体中没有观察到这种影响。这些结果证实,E2FB而非E2FA在细胞增殖中发挥关键作用,以保护它们免受复制胁迫引发的细胞增殖停滞。 图3. 在pol2a背景中,E2FB的丢失进一步减少了根尖分生组织的长度 为了进一步剖析E2FB如何影响细胞增殖以应对复制胁迫,作者对所有突变体组合的细胞周期进展进行了更详细的分析。作者首先分析了花蕾中细胞核的细胞周期阶段分布,在野生型、sog1、e2fb-1单突变体和e2fb-1 sog1双突变体中,各细胞周期阶段的细胞核比例相同(图4A)。在所有含有pol2a的突变组合中,S期细胞的比例都增加了,这与作者之前的发现一致。此外,作者观察到,与pol2a和pol2a sog1突变体相比,e2fb-1pol2a和e2fb-1pol2a sog1突变体中G2核的比例增加,而G1核的比例下降(图4A)。在e2fa-1突变体组合中没有观察到这种现象。这些数据表明,E2FB对暴露于复制胁迫的细胞通过G2的细胞周期进展和G2/M过渡的开始起着积极的调节作用。 作者接下来对四天龄的幼苗进行了乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)的累积标记。在pol2a sog1 e2fb-1三重突变体中,EdU的掺入极其缓慢,这使得很难像前面描述的那样可靠地估计细胞周期或S期长度。作为替代方案,作者计算了施用EdU 5h后显示EdU标记的有丝分裂的根的比例,以监测不同突变组合对S和G2进展的影响。正如预期的那样,与野生型相比,pol2a突变体中标记有丝分裂的比例减少,而sog1、e2fb-1或e2fb-1 sog1突变体中标记有丝分裂的比例不变(图4B)。此外,e2fb-1pol2a 双突变体和e2fb-1pol2a sog1三重突变体分别比pol2a和pol2a sog1突变体显示更低的标记有丝分裂百分比(图4B)。综上所述,这些结果证实了在复制胁迫下,E2FB是细胞周期进展到G2所必需的,并且在没有SOG1的情况下,这一功能尤其重要,这表明SOG1和E2FB可能同时发挥作用,以维持复制胁迫暴露的细胞的增殖能力。 图4. 复制胁迫反应中E2FB正向调节G2/M进程 4. E2FB和SOG1都调节复制胁迫诱导基因的表达 为了深入了解E2FB在复制胁迫反应中的作用机制,作者比较了pol2a、pol2a sog1和e2fb1 pol2a sog1突变体茎尖的基因表达的变化。与野生型植株相比,在pol2a、pol2a sog1和e2fb-1 pol2a sog1突变体中分别发现了1822、2599和3512个上调基因。其中,1095个基因在所有三个突变系中普遍上调(图5A)。对这1095个基因进行GO分析显示,DNA修复、DNA复制和细胞周期负调控等GO terms显著富集(图5B),这与POL2A缺乏引发的组成型复制胁迫和诱导的细胞周期缺陷一致。正如预期的那样,在e2fb-1 pol2a sog1突变体中特异性上调的基因在E2F靶基因中并不富集,这表明它们中的大多数可能是由E2Fs间接调控的。 为了了解SOG1靶基因在不同基因型中的行为,作者对pol2a、pol2a sog1和e2fb-1 pol2a sog1突变体中SOG1靶基因的表达水平进行了k-means聚类分析(图5C)。在309个SOG1靶基因中,有78个靶基因在至少一个基因型中与野生型相比显著上调,并被保留在分析中。这种方法揭示了六个表现出不同表达谱的基因簇,簇1中的基因似乎只受SOG1控制,因为它们在pol2a突变体中上调,而在pol2a sog1或e2fb-1 pol2a sog1突变体中不上调,并且不富集在 E2F靶标中。相反,簇3中的基因主要受e2fb-1突变的影响,因为它们在pol2a和pol2a sog1突变体中仅轻微上调,而在三重突变体中则非常强烈上调。其余簇中的基因则同时受到E2FB和SOG1的影响。簇4和簇5包含在所有三个突变系中上调的基因,尽管这种诱导在sog1突变背景中不那么明显。其中,一些在pol2a sog1和e2fb-1 pol2a sog1突变体中的表达水平相似,而另一些在缺乏E2FB的情况下表达上调。同样,与pol2a单突变体相比,簇2基因在pol2a sog1突变体中表达水平下调,而在三重突变体中表达水平升高,表明这些SOG1靶基因受到E2FB和SOG1的拮抗控制。有趣的是,簇2、簇4 和簇5在E2F靶标中特别丰富,进一步支持了它们受SOG1和E2FB双重控制的假设。事实上,与pol2a sog1突变体相比,e2fb-1 pol2a sog1三重突变体中上调的基因明显富集了SOG1靶标(图5D),这进一步证实了真正的SOG1靶点可以独立于SOG1被激活以响应复制胁迫。 在似乎受SOG1和E2FB拮抗控制的共用E2FB/SOG靶标中,作者发现ANAC044和ANAC085转录因子基因(分别位于簇4和簇2中)已被证明负调控G2/M进展,RT-qPCR证实了这一结果。有趣的是,ANAC044和ANAC085不仅是SOG1和E2FB的直接靶标,也是RBR1的靶标,这表明E2FB可通过与RBR1的相互作用抑制它们。 综上所述,作者的转录学结果表明,SOG1和E2FB对它们的共同靶标大多具有拮抗作用,E2FB可能在缓解SOG1诱导的细胞周期停滞基因的诱导方面发挥重要作用。有趣的是,与野生型植株相比,在pol2a sog1和e2fb-1pol2a sog1突变体中特异性上调而在pol2a单突变体中没有上调的所有基因的GO分析表明,与细胞周期调控相关的基因显著富集。此外,E2FA和E2FB靶标在该列表中也显著富集。值得注意的是,E2F靶标在所有三个突变系中普遍上调的基因中也高度富集。这些结果共同表明,其他E2Fs,尤其是E2FA,可能参与了这些基因的调控。 图5. E2FB和SOG1协同控制复制胁迫诱导的转录变化 5. E2FA、E2FB和SOG1协同作用,允许细胞周期进程以响应复制胁迫 为了检验E2FA在缺乏E2FB和SOG1的情况下是否有助于参与复制胁迫响应,作者使用了E2FA的部分功能丧失等位基因(e2fa-2),并产生了e2fa-2 e2fb-1 sog1三重突变体。为了诱导复制胁迫,将试管苗暴露于复制抑制剂HU。正如之前发表的那样,sog1突变体对复制胁迫略微敏感,而e2fa、e2fb和e2fa-2 e2fb-1则没有表现出这种超敏反应(图6)。e2fa和e2fb突变等位基因的表现相同。同样,在对pol2a突变体诱导的组成型复制胁迫的反应中(图2B),e2fb-1 sog1而非e2fa-1 sog1双突变体对HU比sog1突变体更敏感,这与E2FB在复制胁迫反应中的作用比E2FA更显著的假设一致。值得注意的是,e2fa-2 e2fb-1 sog1三重突变体表现出更强的HU超敏反应,转移到HU上后根的生长几乎完全受阻(图6),根分生组织中的细胞死亡被诱导,这揭示了在E2FB和SOG1失活时E2FA对复制胁迫反应的贡献。 图6. E2FA、E2FB和SOG1的同时缺失使植物丧失了耐受复制胁迫的能力 最后,由于在S期分叉进程受阻是不可避免的,作者研究了E2F缺乏是否会在野生型背景下引发复制胁迫。事实上,e2fa-2 e2fb-1双突变体(而非单突变体)表现出根分生组织大小减小和细胞增殖略有减少。虽然这种表型可能是由于E2Fs作为细胞周期进展激活剂的作用,但它也可能反映了对S期通常发生的基础水平复制胁迫的低效反应。与这一假设相符,作者发现e2fa-2 e2fb-1双突变体的S期延长,细胞周期总长度增加(图7)。重要的是,这些缺陷被sog1突变消除,表明E2F缺乏会引发复制胁迫,导致SOG1依赖性细胞周期延迟。 图7. E2F缺乏触发复制胁迫和SOG1依赖的细胞周期延迟 为了证实这一假设,作者对在对照条件下生长的7日龄幼苗的根尖进行了RNA-Seq分析。在e2fa-2 e2fb-1突变体中,共发现148个基因下调,根据ChIP数据,其中73个基因可能是直接的E2FA或E2FB靶基因(图8A)。该列表包括DNA复制机制的描述组件和GO富集类别,包括DNA复制起始,DNA双链解离和染色质组装。除了148个下调基因外,作者还发现345个基因上调,根据ChIP数据,其中145个基因是E2FA或 E2FB结合基因(图8A),这与最近的证据一致,即典型的E2FA/B可能通过与RBR1的关联在细胞周期基因的抑制中发挥关键作用。 E2F结合上调基因列表中富集的GO类别主要指DNA修复、重组修复以及对伽马辐射和X射线的反应。从下调基因和上调基因中选择一些基因进行定量 RT-PCR分析,证实了 RNA-Seq 的结果(图8B,C)。值得注意的是,在e2fa-2 e2fb-1双突变体中上调的PARP1和SMR7基因的表达在e2fa-2 e2fb-1 sog1三重突变体中受到抑制。与没有转录抑制的MCM9基因不同,前两个基因是真正的SOG1靶基因,表明E2FA和E2FB的缺失会引发SOG1依赖性转录反应(图8C)。因此,在e2fa-2 e2fb-1双突变体中上调的345个基因中,有43个是SOG1的靶基因,进一步证实了E2FA和E2FB的缺失会引发复制胁迫和SOG1依赖性的DDR基因激活。 图8. e2fa-2 e2fb-1突变体差异表达基因分析 研究小结 在本研究中,作者研究了E2FA和E2FB参与复制胁迫反应的情况。令人惊讶的是,作者发现E2FA和E2FB与SOG1有许多共同的靶标。此外,作者还发现,尽管存在复制胁迫,但细胞周期的进展需要E2FB而非E2FA的活性。对SOG1和E2F共同靶标表达行为的深入分析表明,E2FA和E2FB在这一通路中既互补又有区别。 在未来还需要进行更精细的研究,以了解在基因表达水平上发生的一系列事件,以及 E2FA、E2FB、SOG1和可能的其他E2F家族成员之间的相互作用是如何实现对细胞周期和DNA修复基因的精细调控,从而在不损害基因组完整性的情况下维持生长的。 图9. SOG1,E2FA和E2FB作用于不同的和共同的靶标,以微调植物的DDR 原文链接:https://doi.org/10.1101/2023.01.06.523015 · 爱基百客ChIP-seq相关介绍 · ChIP-seq技术将染色质免疫共沉淀和二代测序技术结合,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,可用于组蛋白修饰、RNA聚合酶、转录因子和辅因子以及G4链体(G4)等方面的研究,技术成熟稳定。爱基百客ChIP-seq可提供:
Peak分析: Peak注释和分布分析,Peak关联基因的GO、KEGG的注释和富集分析, 转录因子和Motif分析等。 多样本差异分析:差异 Peak 分布情况统计,差异 Peak 关联基因GO、KEGG 功能注释与富集,转录因子预测,Motif 预测等。 · 后续验证 01 ChIP-qPCR 分析组蛋白修饰/转录因子与染色质区域的结合情况,揭示染色质状态和基因表达调控之间的关系,真实反映结合特性。 02 EMSA 基于DNA-蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中的迁移率不同,检测活化的与DNA结合的蛋白转录或调节因子。 03 双荧光素酶报告实验 检测转录因子与靶启动子的特异结合。 · 爱基百客ChIP-seq三大优势 优势一:项目经验丰富,研究物种200+种,累计实验2000余次。全面覆盖医口和农口等不同样本,不惧特殊样本(如脂肪组织、高淀粉组织和真菌类),抗体经验也极其丰富(多种组蛋白修饰、转录因子、标签抗体以及p300和RNApol II等均有涉及); 优势二:提供前期实验设计、测序、分析以及后期验证(ChIP-qPCR、EMSA)一站式服务; 优势三:项目文章多次发表于Cancer Cell、Nature Plants、Nature Metabolism以及Plant Cell等期刊。 精选合集,欢迎收藏哟! |