干货分享：微生物测序怎么选？这篇文章告诉你……

微生物个体微小，必须借助科学仪器才可观察。但微生物数量庞大，广泛分布于周遭环境和动植物体内，并且影响着人类健康、动物生长和植物耕作等。

ISBN: 978-1-951285-03-6

微生物组研究分为三种层面：微生物、DNA和mRNA。其中扩增子测序、宏基因组测序、宏转录组测序分别用于微生物基因和转录水平的研究。本文也将主要对这3种技术进行介绍。

对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序。对样本进行16S、18S、ITS和功能基因高变区扩增产物进行测序。基于二代和三代测序平台可实现属/种水平上的微生物组成鉴定。

对于扩增子测序，其测序对象是DNA。

1. 细菌16S rDNA

原核生物核糖体由5S rRNA、23S rRNA和16S rRNA构成。其中编码16S rRNA的基因具有以下特点：普遍存在于原核生物中、大小合适（1540nt）、拷贝数高、模板以获取且具有高度保守区（同源性）和高度变化区(变异、进化)。适合于细菌的多样性分析。

16S rDNA序列共有9个保守区和9个高可变区。根据样本的不同，测序区域有所差异。

V3-V4:一般细菌多样性分析选择区域，也适用于肠道样本。

V5-V7: 植物内生菌等含植物宿主污染样本。

V4-V5: 土壤和淤泥等环境样本。

2. 真核生物18S rDNA

在真核生物中，18S rDNA V4区数据库信息最全、分类效果好，是18S rRNA基因分析注释的最佳选择（藻类和原生生物等）。

3. 真菌ITS

ITS序列是内源转录间隔区，是真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间区域，分别为ITS1（350bp）和ITS2（400bp）。

ITS1:常规选择。

ITS2：适用于发酵类样本和土壤等。

4. 功能基因扩增子测序

功能微生物指具有特定生物学功能的微生物。每种功能微生物在分类学上可能有很大不同，但却具有相类似的基因使其能够发挥同样的功能，因此使这些功能细菌发挥这种特定功能的基因就称为功能基因，如nxrA、nirS/nirK、amoA、dsrB、nifH、nifH。针对功能基因进行引物设定、扩增和测序即功能基因扩增子测序。

功能微生物及功能基因（部分）

• 16S测序流程

扩增子测序技术的测序流程基本一致，我们以16S扩增子测序流程为例进行介绍。

提取样品总DNA后，根据保守区设计引物，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，再进行质检，测序和数据分析。

16S扩增子测序流程如下图所示：

1998年，Jo Handelsman提出共基因组的概念“The genome of the total microbiota found in nature”即：环境中所有微生物基因组的总和。与扩增子测序不同，基因组对样本中所有微生物群体的基因组进行测序，不对特定种群进行单一性测序。宏基因组测序能够进行微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、互作关系以及环境之间的关系等研究。

• 宏基因组测序流程

与扩增子测序不同，宏基因组测序不需要进行PCR扩增，直接对样本进行DNA提取后即进行建库测序等后续流程。

特定条件下，环境/组织样本中所有的微生物RNA的集合，利用高通量测序，可以直接获得样本中所有微生物转录组信息，能够从转录水平研究复杂微生物群落变化，挖掘潜在的新基因。

• 宏转录组测序流程：

宏转录组的研究对象是样本中所有微生物RNA的集合，mRNA富集时采用rRNA去除的方法。后续测序文库构建的步骤和普通转录组测序一致。

对于这三种技术方法，在进行实验选择时，需结合样本特点和研究目标进行综合评估。下图是扩增子测序、宏转录组和宏基因组的技术比较：

根据实验目的的不一致，我们推荐一下选择方法：

1) 只需要研究样本中微生物的多样性和群落构成，不需要进行更深一步的功能分析，推荐扩增子测序技术。

2) 除了需要进行微生物物种层面的研究之外，还需要进一步相关基因和功能的研究，推荐宏基因组测序技术。

3) 扩增子+宏基因组联合分析：扩增子测序和宏基因组测序的研究目的和深度存在不同，在进行研究时可先使用扩增子测序对多重复/大样本量进行筛选，剔除离群样本。选择重复性好的样本进行宏基因组测序，进行深入研究。

4) 扩增子+宏基因组+宏转录组：多组学联合分析可更好了解样本中微生物群体“存在哪些微生物、微生物能做什么和微生物正在做什么”的问题，做到“全面研究”。

扩增子测序、宏基因组测序、宏转录组测序分别解决“存在哪些微生物”“ 微生物能做什么”“微生物正在做什么”的问题，这些技术的应用领域重叠，但研究深度不同。以下是微生物研究领域简介。

（1）医学领域

• 人体微生物研究：阴道菌群、皮肤微生物群等研究。

• 疾病研究：疾病诊断和预测，代谢类疾病、消化类疾病、自身免疫性疾病和耐药基因检测等。

• 癌症研究：癌症类型诊断和预测，治疗靶点发现等。

（2）环境领域

• 特定环境下微生物研究。

• 有机肥发酵处理、污水治理、石油降解、水体及海洋环境等环境相关问题。

（3）农业方向

• 肠道、瘤胃等微生物与动物繁殖、生长发育、营养健康、免疫和疾病治疗等的互作关系研究。

• 根际微生物与植物互作、农业耕作/施肥处理与土壤微生物等研究。

（4）生物能源

• 特殊功能菌株、基因挖掘、工程菌开发等

（5）极端环境

• 极端环境下相关微生物研究。例如：古菌。

以上我们分别对扩增子测序、宏基因组和宏转录组进行了介绍。接下来我们以几个例子看看这些技术可以进行哪些方面的研究？

案例一：HIV相关性慢性肺病患儿的痰细菌载量和细菌组成与肺功能相关，长期服用阿奇霉素后发生改变

艾滋病毒相关慢性肺病(HCLD)是艾滋病毒最常见的慢性并发症，占所有艾滋病毒相关死亡率的50%以上。该病的症状包括呼吸困难、运动耐受性降低、疲劳和慢性咳嗽。尽管这种HIV相关的闭塞性细支气管炎的发病机制尚不清楚，但实验表明长期阿奇霉素(AZM)治疗可降低患有艾滋病毒相关慢性肺病(HCLD)的儿童和青少年急性呼吸恶化的频率。但这种治疗对呼吸道细菌群的影响尚不清楚。

2023年2月南非开普敦大学Mark P. Nicol团队在Microbiome期刊以“Sputum bacterial load and bacterial composition correlate with lung function and are altered by long-term azithromycin treatment in children with HIV-associated chronic lung disease”为题发表论文，该研究表明AZM治疗保留了痰中细菌的多样性，并降低了HCIL相关的细菌Haemophilus 和 Moraxella的相对丰度。这些细菌学作用与肺功能的改善有关，可能解释AZM治疗HCLD儿童相关的呼吸恶化减少的原因。

• 技术路线：

案例二：通过宏基因组和宏转录组数据的综合分析洞察阴道细菌的生态学

人体中的微生物群落是健康的关键决定因素。育龄妇女阴道微生物群大致可分为五种不同的群落状态类型(CSTs)。其中四种乳酸菌（CST I -卷曲乳酸杆菌，CST II-加氏乳酸杆菌，CST III-加氏乳杆菌，CST V-简氏乳杆菌）的相对丰度较高，CST IV主要由严格厌氧菌和兼性厌氧菌等多种微生物混合组成。以乳酸菌种类为主的阴道细菌群落与各种不良健康结果的风险降低有关，但驱动这些改变的因素目前还不清楚。

2022年3月美国马里兰大学医学院Jacques Ravel团队在Genome Biology期刊以“Insight into the ecology of vaginal bacteria through integrative analyses of metagenomic and metatranscriptomic data”为题发表论文，该研究发现阴道转录组学数据可预测群落组成的未来变化，用于阴道疾病早期诊断，如有症状的细菌性阴道炎。此外，宏转录组数据结果可指导制定创新策略，调节阴道菌群的组成和活动，以恢复和维持一个最佳的保护环境。

• 技术路线：

案例三：宏基因组学揭示丛枝菌根真菌改变根际微生物群落的功能基因表达以增强虹膜对铬胁迫的抵抗力

铬(Cr)会破坏植物正常的生理代谢功能，严重影响微环境。而已有研究表明定植于根的有益微生物(块状菌根真菌、根杆菌、抗病菌等)可促进Cr污染土壤中植物的生长发育，从而提高Cr 污染土壤的修复效率。丛枝菌根真菌(AMF)可与寄主植物形成专性共生，并与根际微生物建立互作胁迫机制，从而增强寄主植物对Cr胁迫的耐受性。然而，Cr胁迫下接种AMF对鸢尾根际微生物的影响，以及根际微生物与宿主和污染物相互作用的机制研究有限。

2023年6月贵州民族大学生态环境工程学院朱四喜团队在Science of the Total Environment期刊以“Metagenomics reveal arbuscular mycorrhizal fungi altering functional gene expression of rhizosphere microbial community to enhance Iris tectorum's resistance to Cr stress”为题发表研究成果，该研究发现AMF可显著提高鸢尾生物量和养分水平，降低土壤中Cr含量；改变根际微生物群落的结构和组成；增加根际微生物群落中养分循环(N, P)相关功能基因的丰度与重金属抗性和转运体相关的功能基因的丰度；提高根际微生物群落的复杂性和稳定。这些为菌根共生系统促进植物生长的有益机理提供了证据，并证明AMF修复Cr污染土壤的潜力。

• 技术路线：

案例四：根际细菌的宏基因组学研究及其在甘草化感作用中的缓解作用

化感作用是植物和/或微生物之间的相互作用。植物通过自毒（化感作用形式）向环境中释放的化感物质影响自身生长和发育不利。相比一般植物，药用植物更有可能表现出化感作用的自毒性。而在植物生长过程中，化感物质可能通过根系渗出、挥发、分解和淋滤等途径进入土壤环境。因此，根际微生物群落对植物发育至关重要。然而，现今对甘草中化感物质影响下的根瘤菌群落的了解仍然有限。

2023年5月西北农林科技大学韦革宏和焦硕教授团队在Microbiome期刊以“Metagenomics insights into responses of rhizobacteria and their alleviation role in licorice allelopathy”为题发表研究成果，该研究发现外源甘草酸抑制甘草发育，重塑和丰富了与甘草酸降解相关的特定根瘤菌和相应的功能。此外，Novosphingobium在富集类群中所占比例较高，出现在宏基因组组装基因组中。进一步表征单一和合成接种剂降解甘草酸的不同能力，发现单一和合成接种剂减轻甘草化感作用效力不同。其中，单补N (Novosphingobium resinovorum)接种剂对甘草幼苗化感作用的缓解效果最大。

• 技术路线：

案例五：高脂肪饮食通过调节肠道微生物群和代谢物促进结直肠肿瘤的发生

结直肠癌(CRC)是世界上第三大最常见和最致命的癌症作为最重要的因素之一，过量的膳食脂肪摄入与CRC风险增加密切相关，与其他类型的癌症不同，结直肠癌在肿瘤发展过程中直接与数万亿肠道微生物相互作用。肠道菌群的组成受多种因素的影响，包括饮食、药物和基因改变，而微生物谱的改变可引起生态失调和CRC。然而，膳食脂肪摄入与结直肠癌发展之间的潜在机制仍不清楚。

2022年1月香港中文大学于君团队在Gastroenterology期刊以“High-Fat Diet Promotes Colorectal Tumorigenesis through Modulating Gut Microbiota and Metabolites”为题发表研究成果，该研究结果表明HFD通过诱导小鼠肠道微生物生态失调、代谢改变和肠道上皮屏障功能受损来驱动结直肠癌的发生。HFD调节的肠道微生物群可以通过提高致癌基因表达和损害肠道屏障功能来促进结直肠癌的发生。因此调节肠道微生物群和代谢物可能是预防和治疗HFD相关CRC的潜在治疗策略。

• 技术路线：

扩增子测序、宏基因组和宏转录组技术能够更好地进行不同环境、不同样本的微生物多样性和相关功能的研究。促进相关疾病、动植物生长和环境保护的研究。

• 参考文献：

[1]Liu YX,Qin Y,Chen T, et al. A practical guide to amplicon and metagenomic analysis of microbiome data. Protein Cell. 2021;12 (5):315-330. doi:10.1007/s13238-020-00724-8

[2] Abotsi RE,Dube FS,Rehman AM, et al. Sputum bacterial load and bacterial composition correlate with lung function and are altered by long-term azithromycin treatment in children with HIV-associated chronic lung disease. Microbiome. 2023;11 (1):29. doi:10.1186/s40168-023-01460-x

[3] France MT,Fu L,Rutt L, et al. Insight into the ecology of vaginal bacteria through integrative analyses of metagenomic and metatranscriptomic data. Genome Biol. 2022;23 (1):66. doi:10.1186/s13059-022-02635-9

[4] Zhao W,Chen Z,Yang X, et al. Metagenomics reveal arbuscular mycorrhizal fungi altering functional gene expression of rhizosphere microbial community to enhance Iris tectorum's resistance to Cr stress. Sci Total Environ. 2023;895:164970. doi:10.1016/j.scitotenv.2023.164970

[5] Liu Y,Wang H,Qian X, et al. Metagenomics insights into responses of rhizobacteria and their alleviation role in licorice allelopathy. Microbiome. 2023;11 (1):109. doi:10.1186/s40168-023-01511-3

[6] Yang J,Wei H,Zhou Y, et al. High-Fat Diet Promotes Colorectal Tumorigenesis Through Modulating Gut Microbiota and Metabolites. Gastroenterology. 2022;162 (1):135-149.e2. doi:10.1053/j.gastro.2021.08.041

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