喜讯 | Circulation（IF:37.8）ChIP-seq+RNA-seq助力解析USP28在糖尿病性心脏病的调控机制

2023年11月23日，国际知名期刊Circulation（IF:37.8&）在线发表了武汉大学人民医院心内科唐其柱教授团队题为 ” USP28 Serves as a Key Suppressor of Mitochondrial Morphofunctional Defects and Cardiac Dysfunction in the Diabetic Heart” 的文章。该研究证实了USP28在糖尿病心脏中的保护作用，尤其是在长期糖尿病的情况下，它能改善心脏的收缩和舒张功能，减轻心脏肥大和纤维化。该研究利用RNA-seq、ChIP-seq、质谱分析和蛋白pull-down等技术手段发现USP28（泛素特异性蛋白酶28）直接与PPARα(过氧化物酶体增殖物激活受体α)互作，去泛素化和稳定PPARα，促进Mfn2转录，从而阻碍线粒体形态功能缺陷。爱基百客为该研究提供ChIP-seq和RNA-seq的技术支持。

糖尿病心肌病（DCM）是一种由糖尿病相关炎症、葡萄糖和脂质代谢紊乱以及线粒体功能障碍引起的心肌结构和功能异常，这种状况独立于高血压、冠状动脉病和瓣膜心脏病。随着全球糖尿病患者数量的增加，DCM的发病率也在上升，对糖尿病患者的心脏健康构成了重大威胁。在DCM的发病机制中，线粒体功能障碍起着核心作用。线粒体动力学，包括线粒体的裂解和融合，与DCM的发展密切相关。线粒体裂解主要由一系列线粒体动力蛋白控制，而线粒体融合则由如Mfn1、Mfn2和Opa-1等蛋白质调节。此外，泛素化和去泛素化在调节细胞内蛋白质稳态和酶活性中发挥关键作用，去泛素化酶通过去除多肽上的泛素来抑制E3连接酶活性，是泛素化调节中的关键分子。

PPARs（过氧化物酶体增殖物激活受体）是一类调节脂质和葡萄糖代谢及能量稳态的转录因子。PPARα特别在心脏中表达水平较高，其激活促进线粒体脂肪酸氧化，在糖尿病心脏中通常表达减少。PPARα在DCM心功能障碍发展，特别是持续糖尿病中的作用尚未得到充分的评估，需要进一步研究。此外，以往对USP28的研究主要集中在癌症信号通路上；然而，人们对USP28在心血管疾病，特别是糖尿病心脏中的作用知之甚少。

1. USP28在糖尿病心脏中的表达显著下调，并与DCM进展相关

在这项研究中，作者分析了db/db和db/m小鼠左心室组织的基因表达谱，目的是识别可能导致糖尿病心脏功能障碍的关键因素。GO分析显示，泛素介导的蛋白降解过程在这些差异表达基因中显著增加。作者进一步关注了与去泛素化酶功能相关的差异表达基因，发现有5个基因表达上调，11个基因表达下调（图1A）。特别是，USP28基因在糖尿病心脏中的表达显著下降。USP28在心脏组织中含量丰富，在db/db小鼠中，其mRNA水平与对照组相比显著下降。因此，作者将研究重点转向了USP28。

通过免疫印迹和免疫荧光染色，作者验证了糖尿病小鼠心脏中USP28的减少（图1B和1C）。此外，作者评估了24周大的雄性和雌性db/db小鼠心脏中USP28的表达，发现无论是雄性还是雌性小鼠心脏中的USP28都有所减少，这表明2型糖尿病触发的心脏USP28减少与性别无关。这些发现强调了USP28在糖尿病心脏病理学中的潜在重要性。

通过分析来自正常捐赠者和糖尿病患者的心脏样本，作者发现在糖尿病患者心脏中USP28的表达显著降低（见图1D和1E）。值得注意的是，USP28在心脏中的表达量与心力衰竭的严重程度呈负相关关系（图1F）。作者还使用免疫印迹和实时聚合酶链反应的技术确认了这一发现，表明糖尿病患者心脏中USP28的mRNA和蛋白水平均显著低于非糖尿病个体（图1G和1H）。此外，作者用高葡萄糖和棕榈酸处理的新生大鼠心室肌细胞（NRVMs），以及人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs），模拟高血糖和高脂血症环境。在这些模型中，USP28的表达也显著降低（图1I至1K）。特别是，在2型糖尿病刺激下，尽管细胞质中的USP28略有下降，但主要是核分馏中的USP28显著减少，这揭示了核内USP28与2型糖尿病的相关性。这些发现揭示了USP28在糖尿病性心肌病（DCM）发展中的重要作用，为进一步的研究提供了新的视角。

图1. USP28 表达在糖尿病心脏中显着下调，并与糖尿病心肌病进展相关

2. 心脏 USP28 的恢复可改善糖尿病心脏的心脏重塑和功能障碍

为了探究USP28在糖尿病心脏中的作用，作者通过尾静脉注射rAAV9-cTnT-USP28，特异性地在小鼠心肌细胞中过表达USP28，并设空白对照组。24周龄时，进行超声心动图检查。免疫印迹和免疫荧光染色确认了USP28在心肌组织中的过表达，并显示rAAV9-USP28注射显著增加了小鼠心脏中USP28蛋白表达，但在其他器官未增加。db/db小鼠的FBG水平、体重、血压和心率无显著差异。超声心动图显示db/db小鼠左心室收缩功能障碍，在rAAV9-USP28注射后有所改善（图2A和2B）。二尖瓣血流速度的E/A比率测量表明db/db小鼠舒张功能受损，而rAAV9-USP28改善了舒张功能（图2C和2D）。E/E'比率分析显示24周龄db/db小鼠左心室充盈压增高，而USP28过表达改善了这一比率（图2E和2F）。rAAV9-USP28处理的db/db小鼠心肌细胞中胞质钙瞬态也得到改善。24周龄的雄性和雌性rAAV9-USP28处理的db/db小鼠在LVEF和E/A比率方面差异有限。这些结果表明，USP28的恢复改善了db/db小鼠的心脏收缩和舒张功能。

作者评估了db/db小鼠心脏形态，发现USP28减轻心肌肥大，表现为心脏大小（图2G）和心脏重量/胫骨长度比率降低（图2H）。小麦胚芽凝集素染色显示，USP28过表达的db/db小鼠心肌细胞横截面积较小（图2I和2J）。USP28还减轻了左心室胶原沉积，如胶原体积减少所示（图2K和2L）。免疫印迹结果表明USP28降低了BNP、β-肌球蛋白重链和胶原I蛋白水平。这些数据表明，USP28恢复改善了糖尿病心脏的重塑和功能障碍。

图2.心脏 USP28 的恢复可改善糖尿病心脏的心脏重塑和功能障碍。

3. USP28阻碍脂质积累并逆转 ROS 产生、线粒体功能障碍

为探究USP28改善心脏重塑和功能障碍的机制，作者对rAAV9-USP28和rAAV9-null处理的db/db小鼠左心室组织进行RNA测序分析。分析发现，代谢和线粒体过程在USP28处理的心脏中富集。Oil Red O染色显示，USP28减少了糖尿病小鼠心脏的脂质积累（图3A和3B）。脂质组分析显示USP28降低了糖尿病心脏的脂质过载。USP28还减少了db/db小鼠心肌中的脂质滴数量（图3C和3D），改善了24周龄db/db小鼠心肌组织中的线粒体嵴损伤（图3E和3F），并增加了ATP产生。免疫印迹结果显示，USP28恢复了db/db小鼠的Mfn1表达，减少了Drp1S616磷酸化（图3G和3H）。

RNA测序结果表明，USP28过表达的小鼠中与线粒体融合相关的基因增加，与线粒体裂解相关的基因减少。USP28促进了参与FA氧化的基因表达，改善了糖尿病心脏的脂质代谢。电子显微镜分析和线粒体DNA含量测定显示，USP28恢复减轻了糖尿病心脏的线粒体变化。此外，免疫印迹分析显示，复合体I至V的主要亚基在不同组间无明显差异。db/db小鼠心脏ROS含量和脂质过氧化增强，而USP28减轻了这些现象。此外，USP28恢复了24周龄db/db小鼠的血管生成。

为鉴定USP28在体外线粒体的保护作用，作者使用含USP28（Ad-USP28）或空白转染的腺病毒培养NRVMs，并用低糖或高糖加棕榈酸培养基。免疫印迹显示USP28在NRVMs中成功过表达。Cell Counting Kit-8试验表明，USP28过表达对NRVM活力无影响。USP28过表达减少了HG+PA培养NRVMs的脂质储存。USP28过表达部分正常化了经HG+PA处理NRVMs中线粒体形态（图3I和3J），恢复了HG+PA处理后的氧耗比（OCR）（图3K和3L）。过表达USP28的hiPSC-CMs在HG+PA处理后显示出改善的OCR（图S6E至S6G），并减轻了脂质过载。这些结果表明，USP28的恢复显著改善了糖尿病诱导的脂质积累和线粒体缺陷。

图3. USP28 阻止脂质积累并逆转线粒体功能障碍。

4. 心脏特异性USP28缺失会加重糖尿病心力衰竭和线粒体功能障碍

为研究心脏USP28在糖尿病心肌病中的作用，作者生成了特异性敲除心脏USP28的小鼠（USP28-cKO），并通过将db/m与Myh6-Cre+ USP28fl/fl（Cre+/USP28fl/fl）小鼠杂交，构建了特异性敲除心脏USP28的db/db小鼠（db/db/Cre+/USP28fl/fl）（图4A），USP28的成功敲除通过心脏匀浆和分离的心肌细胞中的免疫印迹得到验证。与过表达USP28的db/db小鼠一致，USP28敲除的db/db小鼠在空腹血糖、体重、血压和心率上无差异。USP28 cKO db/db小鼠显示出更低的LVEF和更高的E/A比率（图4B和4C）。24周龄的雄性和雌性USP28突变db/db小鼠在心脏功能障碍上差异有限。这表明USP28以性别独立的方式调节糖尿病心力衰竭。

糖尿病小鼠表现出左心室结构重塑，如心脏重量/胫骨长度比、心肌细胞横截面积和LV胶原体积增加。USP28 cKO db/db小鼠的心脏肥大和纤维化更显著（图4D至4G）。免疫印迹结果显示，USP28 cKO增加了db/db小鼠中BNP和胶原I蛋白水平。此外，USP28 cKO db/db小鼠脂质储存和受损线粒体增加，ATP产生减少（图4H至4K）。FA摄取和运输相关基因在USP28 cKO db/db小鼠中上调，脂质代谢失衡。线粒体融合相关基因在USP28 cKO db/db小鼠中减少，同时Drp1磷酸化增加和Mfn1表达下调。USP28敲除增加了糖尿病心脏的脂质过氧化和ROS产生，并轻微抑制心脏血管生成。

为验证USP28在体外线粒体的作用，作者用低糖或高糖加棕榈酸培养基培养NRVMs，加入siUSP28或siCTR。免疫印迹显示siUSP28成功敲低NRVMs中的USP28。USP28沉默不影响NRVMs活力，但进一步扰乱了线粒体形态和结构。USP28敲低降低了NRVMs的氧耗比（OCR），表明USP28抑制加重心肌细胞线粒体功能障碍。体外抑制USP28还促进了NRVMs中的脂质过载。与此同时，USP28沉默的hiPSC-CMs在HG+PA处理后OCR降低，脂质积累加重。这些结果表明心脏特异性USP28删除加重了糖尿病心力衰竭、心脏重塑、脂质过载和线粒体功能障碍。

图4. 心脏特异性 USP28 缺失会加重糖尿病性心力衰竭和线粒体功能障碍。

5. USP28 与 PPARα 特异性相互作用，调节 PPARα 的去泛素化修饰和稳定性

为探索USP28改善心肌细胞线粒体和脂质代谢的特定底物，作者进行了免疫沉淀和质谱分析，识别出226个蛋白候选者。PPARα被识别为主要互作蛋白，并证实为PPAR家族中的唯一成员（图5A）。共免疫沉淀实验验证了USP28与PPARα的直接相互作用（图5B）。体外Pull-Down实验显示USP28直接与PPARα结合（图5C）。在人心脏组织中，USP28与PPARα相互作用得到确认（图5D），并发现HG+PA处理的NRVMs中两者的结合减少（图5E）。免疫荧光染色显示USP28和PPARα主要在NRVMs细胞核中共定位（图5F）。通过USP28和PPARα的截短突变体Pull-Down实验，发现USP28的UCH域与PPARα的DBD片段强烈结合（图5G和5H）。

USP28可能通过调节PPARα的翻译后修饰来发挥作用。作者通过去泛素化实验评估PPARα的多泛素化水平，发现USP28显著促进了PPARα的去泛素化（图5I），而在USP28敲低细胞中PPARα泛素化水平上调（图5J）。USP28过表达导致PPARα去泛素化，与AAV-USP28相比，USP28 cKO小鼠显示PPARα去泛素化减少（图5K）。PPARα的泛素化在糖尿病心脏中增加，USP28显著阻断了PPARα的Lys-48链连接的多泛素化，而不是Lys-63泛素化。作者发现PPARα与USP28的相互作用减少了MuRF1参与的泛素化，表明USP28独立于赖氨酸位点调节PPARα的去泛素化。作者还发现赖氨酸-152可能是USP28去泛素化PPARα的关键位点。最后，USP28沉默降低了PPARα蛋白的半衰期，而Ad-USP28感染的NRVMs中半衰期增加（图5L和5M）。这些结果表明，USP28特异性地与PPARα相互作用，进行去泛素化并稳定PPARα。

图5. USP28 与 PPARα 特异性相互作用，调节 PPARα 的去泛素化修饰和稳定性。

6. USP28 通过促进心肌细胞中 PPARα 介导的 Mfn2 转录来调节线粒体稳态

KEGG通路分析和GSEA分析显示，差异表达基因富集于线粒体代谢通路，尤其是PPAR信号通路（图6A）。体内PPARs蛋白表达评估显示PPARα、PPARδ和PPARγ在糖尿病心脏中减少，但只有PPARα被USP28过表达恢复。USP28还恢复了糖尿病心脏中Mfn1和Opa1蛋白表达。免疫荧光显示，USP28过表达恢复了糖尿病心脏中PPARα阳性核（图6B）。USP28一致地恢复了糖尿病心脏中核PPARα水平。与此同时，USP28促进了HG+PA处理的NRVMs中PPARα的核定位，并恢复了核内PPARα蛋白水平（图6C）。

染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）显示PPARα结合位点包括启动子、内含子、基因间区域或外显子（图6D）。PPARα峰相关基因富集于线粒体片段、ATP过程和脂质代谢（图6E）。Mfn2被鉴定为关键基因，PPARα与Mfn2启动子的相互作用在hiPSC-CMs中得到验证（图6G）。USP28 mRNA水平与人类糖尿病心脏中Mfn2 mRNA水平呈正相关（图6H）。荧光素酶实验和前面的研究结果综合表明，USP28促进PPARα核定位，以促进心肌细胞中Mfn2的转录（图6J和6K）。

图6. USP28 通过促进心肌细胞中 PPARα 介导的 Mfn2 转录来调节线粒体稳态。

7. PPARα 的消融很大程度上消除了 USP28 对 db/db 小鼠的心脏保护作用

作者研究了PPARα对USP28改善心脏结构重塑、脂质积累和线粒体紊乱的必要性。通过杂交db/m和PPARα敲除小鼠，作者生成了PPARα敲除的db/db小鼠（PPARα–/– db/db小鼠）。研究发现，PPARα敲除或USP28过表达对db/db或db/m小鼠的体重和空腹血糖无影响。超声心动图显示，与db/m小鼠相比，db/db小鼠有明显的收缩和舒张功能障碍（图7A至7G）。USP28过表达改善了db/db小鼠的心脏功能障碍，但在PPARα敲除的db/db小鼠中，USP28未能改善收缩和舒张功能障碍（图7A至7G）。这些结果表明，PPARα的缺失消除了USP28改善db/db小鼠心脏功能的效果。

在心脏形态方面，USP28过表达减轻了db/db小鼠的心肌肥大，表现为降低的心脏重量/胫骨长度比和心肌细胞横截面积。但PPARα敲除消除了USP28的这些心脏保护效果（图7H和7I）。Masson氏三色染色显示，USP28减轻了db/db小鼠的心脏纤维化，而PPARα敲除db/db小鼠未见改善（图7J和7K）。免疫印迹检测显示，在PPARα敲除db/db小鼠心脏组织中，BNP、β-肌球蛋白重链和胶原蛋白I水平显著升高，USP28过表达未能降低这些水平。Oil Red O染色和透射电子显微镜结果显示，尽管USP28减少了db/db小鼠心肌中的脂质滴和受损线粒体，PPARα敲除db/db小鼠脂质积累更明显，且线粒体受损增加（图7L至7O）。

脂质组分析揭示，USP28恢复抑制了糖尿病心脏的心脏脂质毒性，依赖于PPARα激活。PPARα敲除降低了脂肪酸氧化基因，尽管是USP28过表达的2型糖尿病小鼠。ATP含量检测显示，PPARα敲除消除了USP28过表达在db/db小鼠中诱导的ATP产生增加。USP28升高减轻了ROS积累，但这在PPARα敲除小鼠中被消除。USP28重建改善的血管生成在PPARα突变小鼠中也被消除。这些结果表明，PPARα缺失在很大程度上消除了USP28在db/db小鼠中诱导的心脏保护效果。

为了研究USP28是否依赖于PPARα发挥保护作用，作者从8周龄PPARα突变（PPARα–/–）和对照（PPARα+/+）小鼠提取了成年小鼠心肌细胞（AMCMs），并通过α-actinin抗体进行免疫荧光验证。在HG+PA处理后，PPARα+/+ AMCMs中的线粒体形态由USP28恢复，而在PPARα–/– AMCMs中未见改善。免疫印迹结果显示，USP28过表达提高了HG+PA处理的PPARα+/+ AMCMs中Mfn1水平，降低了Drp1磷酸化。这些变化在PPARα–/–AMCMs中未被USP28改善。在HG+PA条件下，USP28过表达部分恢复了PPARα+/+ AMCMs的最大OCR，但在PPARα–/–AMCMs中未能恢复OCR。这些结果表明USP28以PPARα依赖的方式缓解了线粒体形态功能缺陷。

图7. PPARα 的消除在很大程度上消除了 USP28 诱导的 db/db 小鼠的心脏保护作用。

8. 心肌细胞中 Mfn2 功能的丧失消除了 db/db 小鼠中 USP28 重建诱导的心脏保护作用

考虑到PPARα是一个关键的代谢基因调节器，作者设计了Mfn2功能丧失模型，以证明Mfn2是否对USP28介导的糖尿病心脏中的心脏保护作用是必需的。通过将db/m小鼠与Myh6MerCreMer Mfn2fl/fl小鼠杂交，作者构建了诱导性心脏特异性Mfn2缺陷的db/db小鼠（db/db-Myh6MerCreMer/Mfn2fl/fl），并通过四环素注射诱导Mfn2成功删除。rAAV9-USP28注射提高了Mfn2fl/fl db/db小鼠的LVEF并改善了E/A比率，但未能改善Mfn2功能丧失db/db小鼠的收缩和舒张功能障碍。rAAV9-USP28注射显著减轻了db/db小鼠的心脏肥大和纤维化，但未能改善Mfn2突变db/db小鼠的这些情况。四环素诱导的心肌细胞中Mfn2功能丧失导致收缩功能障碍和心脏肥大，但不影响E/A比率和左心室胶原分布。

对于线粒体缺陷和脂质代谢，USP28过表达未能减轻Mfn2缺陷后的心脏线粒体损伤和脂质积累。值得注意的是，Mfn2条件性功能丧失导致线粒体嵴受损，部分解释了收缩功能障碍和心脏肥大。令人惊讶的是，心肌细胞中Mfn2的基因耗竭导致脂肪酸氧化显著减少，而脂肪酸摄取并未显著改变。这可能由以下原因引起：(1) 作为关键转录因子的PPARα，不仅参与线粒体结构和功能，还驱动靶基因转录，涉及葡萄糖和脂质代谢；(2) Mfn2功能丧失导致线粒体动态失调，阻碍线粒体中的脂肪酸氧化，对脂肪酸摄取影响较小。总体而言，这些数据显示，心肌细胞中Mfn2的消除，消除了USP28重建在db/db小鼠中诱导的心脏保护作用。

9. 心脏 USP28 的恢复可对抗 HFD/STZ 诱导的 2 型糖尿病小鼠的糖尿病性心力衰竭和线粒体紊乱

为评估USP28恢复对糖尿病心肌病的影响，作者使用高脂饮食（HFD）和链脲佐菌素（STZ）构建了2型糖尿病小鼠模型。在STZ/HFD处理前，6周龄的C57BL/6J雄性小鼠接受rAAV9-cTnT-USP28注射，诱导心肌细胞中USP28过表达。STZ/HFD小鼠体重显著增加，空腹血糖（FBG）高于普通饮食（Chow）小鼠，但USP28过表达未影响体重和FBG。超声心动图分析显示，USP28过表达恢复了STZ/HFD小鼠左心室的收缩和舒张功能。组织学分析显示，USP28过表达在STZ/HFD小鼠中减轻了左心室肥大，减小了心肌细胞大小和纤维化（图8C和8D）。这些结果表明，USP28过表达减轻了2型糖尿病小鼠的心脏重塑。

为研究USP28过表达对HFD/STZ诱导的心脏脂质代谢的影响，作者通过Oil Red O染色评估了糖尿病心脏的脂质含量。STZ/HFD小鼠心脏脂质积累增加，但USP28过表达显著抑制了这一变化（图8E和8F）。透射电子显微镜结果显示，USP28过表达减少了STZ/HFD小鼠中的脂质滴数量和失去线粒体嵴的线粒体比例（图8G和8H）。USP28在2型糖尿病小鼠中恢复了心脏的ATP产生。免疫印迹结果显示，USP28过表达在STZ/HFD小鼠中提高了Mfn2、Opa1和PPARα的表达水平。内源性免疫沉淀实验显示，USP28过表达显著抑制了STZ/HFD诱导的2型糖尿病小鼠心脏中PPARα的泛素化水平。总体而言，这些结果表明心脏USP28的恢复抵消了HFD/STZ诱导的2型糖尿病小鼠中的糖尿病心力衰竭和线粒体形态功能缺陷。

图8. 心脏 USP28 的恢复可以抵消 HFD/STZ 诱导的 2 型糖尿病小鼠的糖尿病性心力衰竭和线粒体紊乱。

这篇研究探讨了USP28蛋白在糖尿病心肌病小鼠模型中的作用。研究发现,糖尿病小鼠和患者的心脏组织中USP28的表达降低。在糖尿病小鼠中过表达USP28可以改善心脏功能、重构、代谢和线粒体稳态,而删除USP28会加重病情。机制研究表明,USP28可以与PPARα蛋白相互作用并稳定其表达,PPARα又可以促进线粒体融合蛋白Mfn2的表达。这条USP28-PPARα-Mfn2通路可能有助于在糖尿病环境下维持线粒体和心脏的健康。在PPARα和Mfn2基因敲除的小鼠中进行的额外实验支持了这条通路对USP28保护作用的重要性。总的来说,该研究将USP28确定为通过影响线粒体动力学来调节糖尿病心脏病的关键调控因子,并且这种调控是通过PPARα和Mfn2来介导的。

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