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项目文章（ChIP-seq）|Plant Physiol组蛋白H3K4甲基转移酶DcATX1促进乙烯诱导康乃馨花瓣衰老
2023年5月2日华中农业大学的张帆教授研究团队在期刊Plant Physiology（IF:7.4）发表了题为“Histone H3K4 methyltransferase DcATX1 promotes ethylene induced petal senescence in carnation”的研究论文。该研究结果表明：DcATX1 是一种 H3K4 甲基转移酶，可通过调节 H3K4me3 水平促进 DcWRKY75、DcACO1、DcSAG12 和潜在其他下游靶基因的表达，加速乙烯诱导的康乃馨花瓣衰老。这项研究进一步表明表观遗传调控对于植物衰老过程的重要性。爱基百客为该研究提供ChIP-seq技术支持。
研究背景 康乃馨（Dianthus caryophyllus L.）对乙烯高度敏感，通常作为研究乙烯诱导花瓣衰老机制的模型植物。花瓣衰老由复杂的调控网络控制，组蛋白修饰等表观遗传调控会影响染色质状态和基因表达。 研究思路
研究结果 1. 乙烯诱导康乃馨花瓣衰老过程中H3K4me3水平升高 为了检验组蛋白甲基化H3K4me3是否参与康乃馨花瓣的衰老过程。作者通过WB检测康乃馨开放和衰老过程中花瓣的H3K4me3水平，发现完全萎蔫期(CWS)H3K4me3水平明显升高，表明H3K4me3水平确实在康乃馨花瓣衰老过程中升高（图1A-C）。 进一步研究乙烯是否促进康乃馨花瓣衰老过程中H3K4me3积累。作者使用10 ppm乙烯对康乃馨盛花期（FBS）花朵进行不同时长处理，发现乙烯处理8h可引起明显的花瓣萎蔫表型，24h花瓣萎蔫表型更为严重(图1D)。WB检测花瓣H3K4me3发现乙烯处理12 h后，花瓣中H3K4me3的水平明显积累，且此后水平保持不变(图1、E和F)。因此乙烯可提高康乃馨花瓣衰老过程中H3K4me3水平。 此外，作者通过WB对乙烯处理的不同时间的花瓣中其他组蛋白甲基化（H3K9me2、H3K27me3和H3K36me3）水平和脱落酸处理是否提高不同处理时间的康乃馨花瓣H3K4me3水平进行检测，排除了其他组蛋白修饰和植物激素对花瓣衰老的影响。 乙烯诱导康乃馨花瓣衰老过程中H3K4me3水平升高，说明H3K4me3可能在康乃馨花瓣衰老过程中起重要作用。
图1. 乙烯诱导康乃馨花瓣衰老并提高 H3K4me3 水平 2. H3K4me3修饰与康乃馨中DcWRKY75、DcACS1、DcACO1、DcSAG12和DcSAG29的表达水平呈正相关 作者选取了5个衰老相关基因验证H3K4me3水平的升高与基因表达的关系。 DcWRKY75（乙烯诱导康乃馨花瓣衰老的关键正调控基因）RT-qPCR检测表明乙烯处理能快速诱导DcWRKY75表达(图2A)，且在衰老过程也被快速表达诱导。ChIP-qPCR检测显示，乙烯处理后DcWRKY75不同启动子区域的H3K4me3水平高度富集(图2B)。这表明乙烯可提高DcWRKY75启动子区域的H3K4me3水平，从而增强其表达。此外，乙烯生物合成基因DcACS1和DcACO1以及衰老相关基因DcSAG12和DcSAG29具有相似响应(图2A和B)。 此外，为了进一步证实H3K4me3修饰在这五个乙烯上调基因中对乙烯的响应在全基因组水平上的富集。作者对10 ppm乙烯处理（0、4和24 h）的FBS康乃馨进行H3K4me3 ChIP-seq测序。数据分析表明DcWRKY75、DcACS1、DcACO1、DcSAG12、DcSAG29的启动子区域H3K4me3修饰水平均上调。 H3K4me3参与乙烯诱导的康乃馨花瓣衰老过程。
图2. 乙烯处理下康乃馨花瓣中DcWRKY75、DcACS1、DcACO1、DcSAG12和DcSAG29的相对表达量和基因启动子区H3K4me3富集 3. DcATX1是康乃馨中潜在的H3K4甲基转移酶 被子植物中，组蛋白甲基化水平受组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶的动态调控，组蛋白甲基化主要由SET DOMAIN GROUP (SDG)蛋白和JMJ蛋白完成。 作者对康乃馨中具有潜在H3K4甲基转移酶活性的SDG蛋白进行分析。拟南芥中多种基因已被报道体调节H3K4甲基化水平，但只有ATX1在花期15的花瓣和雄蕊中表达增加。因此，在康乃馨基因组的同源蛋白研究数据库中进行ATX1同源蛋白质检索，共检索到12个同源蛋白质。其中DcATX1在乙烯处理下的表达明显下调。RT-qPCR检测发现DcATX1表达水平在乙烯诱导的花瓣衰老和不同时间发育阶段衰老过程中都逐渐降低(图3A)。此外，DcATX1蛋白水平检测发现乙烯处理后 12 h和不同发育阶段衰老过程中的DcATX1蛋白含量明显升高(图3B)。 乙烯处理是否影响DcATX1蛋白的稳定性？作者发现未经乙烯处理的MG132（蛋白酶体抑制剂）处理使DcATX1蛋白升高(图3C)，这意味着未经乙烯处理的DcATX1蛋白受到26S蛋白酶体的降解。乙烯处理后，DcATX1蛋白增加(图3B)，说明乙烯可以增强DcATX1蛋白的稳定性。此外DcATX1在花瓣中表达水平中等并且定位于细胞核中(图3E)。蛋白质序列比对表明，DcATX1具有典型的SET结构域，这对组蛋白甲基转移酶活性至关重要。 这些数据表明，DcATX1在乙烯诱导的康乃馨花瓣衰老中是一个潜在的H3K4甲基转移酶。
图3. 康乃馨中 DcATX1 的鉴定 4. DcATX1基因沉默延缓乙烯诱导的康乃馨花瓣衰老 为了测试DcATX1在花瓣衰老中的作用。作者利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术构建烟草脆裂病毒载体(TRV-DcATX1)特异性沉默康乃馨植株中的DcATX1。与TRV对照植株相比，DcATX1在TRV-DcATX1沉默植株中的表达水平降低(图4C)，且DcATX1蛋白水平也大幅降低(图4E)。这表明TRV-DcATX1沉默的植物中，DcATX1蛋白水平降低，DcATX1抗体可以特异性识别DcATX1蛋白。 空气条件下，TRV- DcATX1沉默明显延迟康乃馨花瓣的衰老。乙烯处理后，TRV对照植株和TRV- DcATX1沉默植株的花瓣衰老均加速，但TRV- DcATX1沉默植株花寿命仍比TRV对照植株长(图4A和B)。RT-qPCR显示，与TRV对照植株相比，TRV- DcATX1沉默植株中DcWRKY75、DcACO1和DcSAG12表达显著降低(图4D)。此外，无论乙烯处理与否，DcATX1沉默都使康乃馨花瓣色退延缓。 DcATX1基因沉默延缓乙烯诱导的康乃馨花瓣衰老。
图4. 沉默DcATX1延缓乙烯诱导的康乃馨花瓣衰老 5. DcATX1过表达加速乙烯诱导的康乃馨花瓣衰老 在花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(35S: DcATX1)的调控下，构建组成型表达 DcATX1载体，在康乃馨植株中过表达 DcATX1（图5C）。空气条件和乙烯处理下，35S:DcATX1过表达植株的花寿命都短于35S对照植株(图5A和B)。RT-qPCR结果显示，与对照组植株相比，35S:DcATX1过表达植株中DcWRKY75、DcACO1和DcSAG12的表达显著增加(图5D)。无论乙烯处理与否，DcATX1过表达都使康乃馨花瓣色退加速。因此，DcATX1促进乙烯诱导的康乃馨花瓣衰老。 进一步在拟南芥中表达DcATX1过表达载体。与WT相比，35 S: DcATX1过表达品系的花衰老和脱落表型明显加快。RT-qPCR结果显示衰老标志基因AtSAG12和AtSAG29与DcATX1在不同品系中的表达趋势相似。 这些结果表明DcATX1促进拟南芥花瓣的衰老。
图5. DcATX1 的过度表达加速康乃馨花瓣衰老 6. 康乃馨中的DcATX1甲基化H3K4 为了验证DcATX1是否调控H3K4me3修饰，作者通过WB检测TRV-DcATX1沉默植株和35S:DcATX1过表达植株的H3K4甲基化水平。与TRV对照植株相比，TRV-DcATX1沉默植株H3K4me3水平显著降低，但H3K4me2水平显著升高；35S:DcATX1过表达植株的H3K4me3水平显著升高，但H3K4me2水平显著降低(图6A和B)；H3K4me1水平未发生显著变化。这表明，DcATX1是一种潜在的组蛋白H3K4甲基转移酶，可能将H3K4me2甲基化为H3K4me3。 使用体外组蛋白甲基转移酶活性测定鉴定DcATX1是否确实是一个活跃的H3K4甲基转移酶。以融合蛋白MBP- DcATX1为酶源，重组拟南芥组蛋白MBP- H3为底物，S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)为甲基供体，MBP为阴性对照，进行组蛋白甲基转移酶活性测定。通过WB分析产物，使用H3K4me3、H3K4me2、H3K4me、H3和MBP的特异性抗体。结果表明1 h内检测到H3K4me3，且随着反应时间增加逐渐积累，在MBP阴性对照中，即使孵育24小时也未检测到H3K4me3积累(图6C)。H3K4me2和H3K4me1的积累也观察到类似模式(图6C)。该结果表明，DcATX1可以快速甲基化重组拟南芥组蛋白H3，不需要任何其他蛋白质。因此， DcATX1是一种能够催化H3K4甲基化的组蛋白甲基转移酶。
图6. DcATX1充当组蛋白H3K4甲基转移酶 7. DcATX1通过提高DcWRKY75、DcACO1和DcSAG12启动子中H3K4me3水平促进基因转录 由于DcATX1是H3K4甲基转移酶，且DcWRKY75、DcACO1和DcSAG12在TRV-DcATX1沉默植株中表达水平降低，而在35S:DcATX1过表达植株中表达水平升高，因此作者检测DcATX1是否调控这些基因启动子区域的H3K4me3修饰。 TRV- DcATX1沉默植株和TRV对照植株ChIP-qPCR检测发现，除空气条件下的P3区外，DcWRKY75启动子在TRV-DcATX1沉默植株中，经乙烯处理或未经过乙烯处理的不同区域的H3K4me3水平均明显降低；DcACO1启动子在TRV-DcATX1沉默植株经乙烯处理后，P2和P5区域的H3K4me3水平明显降低；无论乙烯处理与否，DcSAG12启动子的P2区域H3K4me3水平都明显降低，TRV-DcATX1沉默植物在空气条件下P1区域H3K4me3水平也明显降低(图7A)。 35S:DcATX1过表达植株和35S对照植株ChIP-qPCR检测发现，空气条件下DcWRKY75启动子在35S:DcATX1过表达植株的不同区域的H3K4me3水平明显升高，乙烯处理后P2区域H3K4me3水平也有所升高。空气条件下，DcACO1启动子在35S: DcATX1过表达植株在P2和P5区域的H3K4me3水平明显升高，乙烯处理后P4区域的H3K4me3水平也升高。DcSAG12启动子在35S: DcATX1过表达植物中，有或没有乙烯处理的 P2区 H3K4me3水平明显升高(图7B)。 因此，DcATX1通过提高DcWRKY75、DcACO1和DcSAG12的启动子中的H3K4me3水平来促进其转录。
图7. 乙烯处理下DcWRKY75、DcACO1和DcSAG12启动子区域的H3K4me3水平和DcATX1积累。 8. 乙烯促进DcATX1在DcWRKY75、DcACO1和DcSAG12的启动子区域的积累 为了解DcATX1是否通过与DcWRKY75、DcACO1和DcSAG12的启动子区域结合来调节H3K4me3水平，以及乙烯是否影响结合活性，作者在乙烯处理的康乃馨花瓣中进行ChIP-qPCR实验。 利用DcATX1天然抗体对康乃馨花瓣进行不经(0 h)和经(24 h)乙烯处理的ChIP实验。与阴性对照相比，未经乙烯处理的DcATX1不与DcWRKY75、DcACO1和DcSAG12的启动子区域结合。乙烯处理下， DcATX1在DcWRKY75、DcACO1和DcSAG12的不同启动子区域显著富集(图7C)。作者利用瞬时转化35S: DcATX1-GFP康乃馨植株进行ChIP实验。结果表明，乙烯处理下DcATX1在DcACO1和DcSAG12的不同启动子区域显著富集。 这些结果表明，乙烯可以促进DcATX1在DcWRKY75、DcACO1、DcSAG12和其他潜在下游靶基因的启动子区域积累，提高H3K4me3水平，从而激活它们的表达，加速康乃馨花瓣衰老(图8)。
图8. DcATX1促进乙烯诱导康乃馨花瓣衰老的示意图 结 语 该研究中作者发现乙烯诱导的康乃馨花瓣衰老过程中H3K4me3增加,且H3K4me3 水平与DcWRKY75、DcACS1、DcACO1、DcSAG12 和 DcSAG29 的表达呈正相关。康乃馨拟南芥同源物DcATX1编码组蛋白赖氨酸甲基转移酶，该酶可以甲基化 H3K4。DcATX1通过调节 H3K4me3 水平促进 DcWRKY75、DcACO1、DcSAG12 和潜在其他下游靶基因的表达，加速乙烯诱导的康乃馨花瓣衰老。 文章链接：https://doi.org/10.1093/plphys/kiad008
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