项目文章| Plant Cell&DAP-seq解析草莓NAC转录因子FvRIF的调控网络

DAP-seq是一种体外研究蛋白与DNA结合的技术，该技术利用麦胚乳表达体系表达目标蛋白然后与基因组DNA文库体外孵育，得到目标蛋白的结合信息。与ChIP-seq和CUT&Tag不同，DAP-seq不需要抗体，在植物中应用更为广泛。今天我们分享一篇2023年发表在The Plant Cell（影响因子：10.676）的文章“Deciphering the regulatory network of the NAC transcription factor FvRIF, a key regulator of strawberry (Fragaria vesca) fruit ripening”。

作者发现二倍体草莓Fragaria vesca中的FvRIF是控制果实成熟的关键调节因子，FvRIF的敲除突变导致果实不能成熟发育。DAP-seq与转录组结合表明，2080个基因是FvRIF介导的调控的直接靶点，包括与果实成熟的各个方面相关的基因。研究表明，FvRIF通过直接调节相关核心基因来调节花青素生物合成和果实成熟。此外，还证明FvRIF与MAP激酶6（FvMAPK6）相互作用并作为其底物，MAP激酶6通过在Thr-310磷酸化FvRIF来调节FvRIF。研究结果揭示了FvRIF介导的转录调控网络在控制草莓果实成熟中的作用，并强调了磷酸化修饰对FvRIF成熟活性的生理意义。爱基百客提供了DAP-seq的分析支持。

作者在二倍体草莓的基因组中鉴定了 FvRIF (FvH4_3g20700)，它是来自 F. × ananassa (maker-Fvb3-4-augustus-gene-182.31) 的 FaRIF 的直系同源物，与 FaRIF 具有 100% 的蛋白质序列同一性。系统发育分析表明，FvRIF 与甜瓜 (Cucumis melo) 中的 CmNAC-NOR（未成熟）和甜橙 (Citrus sinensis) 中的 CsNAC56 关系最密切，其次是番茄 (Solanum lycopersicum) 中的 SlNOR 和 SlNOR-like1 以及 NtNAC56-like烟草（Nicotiana tabacum）中（图 1A）。作者通过RT-qPCR分析了F. vesca和F. × ananassa中的RIF表达，结果表明FvRIF在果实中高表达，并在二倍体草莓的成熟过程中增加（图1B）。

作者还通过CRISPR/Cas9敲除得到突变体植株Fvrif-6和Fvrif-13；Fvrif-6和Fvrif-13突变系显示出类似且明显的抑制成熟表型。（图1G）。突变体中的果实未能完全成熟，并在最后成熟阶段保持白色，这表明FvRIF在控制草莓果实成熟中起主要调节作用。与颜色表型一致，在花后28天（DPA），Fvrif品系的果实中花青素含量下降了>90%（图1H）。相反，Fvrif品系的果实软化受到显著抑制，与野生型相比，其果实硬度高出约18倍（图1I）。

图1：FvRIF的突变导致草莓果实成熟受到抑制

为了更好地理解FvRIF介导的果实成熟的转录调控，作者进行了DAP-seq来找寻FvRIF结合位点；在两个生物重复中检测到总共9902个富集峰，对应于7899个基因（图2A），并且结合位点高度集中在转录起始位点（TSS）上（图2B）；大多数结合位点（37.0%）位于启动子区内（TSS上游2kb）（图2C），这与FvRIF是一种具有DNA结合能力和基因调控活性的TF一致。研究使用Homer工具鉴定了4个富集的基序。最富集的基序由TACGTACGTAAC代表，其占4649个FvRIF结合峰（图2D）。该基序的核苷酸序列为CGT[G/A]，这是一种先前报道过的NAC识别基序，证实了DAP-seq数据的可靠性。作者还鉴定出来了另外3个基序，TAGCTA（A/G）C、CTTC（A/G)TTT和AGAAAGAA，它们分别存在于4473、3500和2222个FvRIF结合峰中（图2D）。对含有FvRIF结合位点的基因GO富集分析显示主要在“转录调节”、“植物激素介导的信号通路”、“细胞壁组织或生物发生的调节”和“发育成熟”等过程（图2E），表明FvRIF可能直接控制与果实成熟相关的多种生物通路。

图2：通过DAP-seq进行FvRIF结合位点的全基因组鉴定

为了鉴定在果实成熟过程中受 FvRIF 转录调控的基因，作者使用野生型和突变体（Fvrif-6 和 Fvrif-13）的 3 个独立生物重复的果实，通过RNA-seq进行了比较转录组分析。分别得到Fvrif-6与WT的差异基因以及Fvrif-13和WT的差异基因信息。通过韦恩图分析得到共上调2747个基因，共下调3959个基因。GO富集分析得到“ABA激活信号通路的调节”、“次级代谢过程的调节”和“葡萄糖代谢过程”等过程的富集（图3E），证实FvRIF在控制果实发育和成熟中的功能。此外，研究还得到了一些众所周知的成熟相关基因，如编码查尔酮合成酶（CHS）的FvCHS1，参与类黄酮生物合成，编码果胶裂解酶（PL）的FvPL2（负责细胞壁分解）和编码9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的FvNCED5（参与ABA生物合成），在Fvrif系中表现mRNA水平的差异表达。

图3：基于转录组的测定FvRIF的调控基因

DAP-seq和RNA-seq联合分析确定 FvRIF 调节的直接靶基因，得到2,080 个共同基因，表明它们是 FvRIF 的直接靶点（图 4A）。其中，769个基因（37.0%）代表FvRIF正向调控的靶标，在Fvrif系中下调，而1,311个基因（63.0%）被认为是FvRIF负向调控的靶标，在Fvrif突变系中上调（图4A）。KEGG通路富集分析表明，FvRIF调控的直接靶基因参与多种代谢通路，包括“植物激素信号转导”、“淀粉和蔗糖代谢”、“苯丙素生物合成”和“类黄酮”生物合成”（图4B）。联合分析结果表明与FvRIF在控制果实成熟中的功能一致，鉴定了与花青素生物合成、细胞壁降解、糖代谢和芳香化合物产生相关的多个基因作为FvRIF的直接靶基因（图4C至F）

图4：FvRIF直接调控靶基因的鉴定

花青素是草莓果实中的主要色素，由苯丙氨酸解氨酶（PAL）、CHS、查耳酮黄烷酮异构酶（CHI）、黄烷酮3-羟化酶（F3H）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）等一系列酶生物合成。）和无色花青素双加氧酶/花青素合酶（ANS）。花青素生物合成途径中的 6 个基因是 FvRIF 直接调控的靶标（图 4C），这与 Fvrif 果实花青素含量与野生型相比的急剧下降一致（图 4C）。并支持 FvRIF 在此途径中的直接作用。因此，作者选择了4个在DAP-seq分析中启动子区域富集值高的基因，即FvCHS1、FvDFR、FvANS和FvUFGT，并通过体外EMSA实验和体内实验ChIP-qPCR进行了验证。RNA-seq分析显示，与野生型相比，FvCHS1、FvDFR、FvANS和FvUFGT在Fvrif-6和Fvrif-13突变系的果实中的表达显著降低（图5E）。RT-qPCR分析证实了RNA-seq结果（图5F），表明FvRIF正调节这些基因的表达。总之数据表明，FvRIF是草莓果实花青素生物合成的关键正转录调控因子。

图5：FvRIF介导的草莓花青素生物合成基因的直接调控

果实软化是由一组细胞壁降解酶催化的，是果实成熟过程中最重要的特征之一。DAP-seq 与 RNA-seq 分析确定了参与果实软化的 7 个基因作为直接 FvRIF 调节的靶标（图 4D）。作者选择了其中 4 个基因进行验证：PL 基因 FvPL2、多聚半乳糖醛酸酶 (PG) 基因 FvPG2、木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶基因 FvXTH 和扩展蛋白 (EXP) 基因 FvEXP3。在 DAP-seq 分析中，所有 4 个基因在其启动子区域均显示富集峰（图 6A）。Y1H分析表明FvRIF与所选基因的启动子相互作用（图6B）。此外，EMSA和ChIP-qPCR测定证实FvRIF可以在体外和体内直接结合这些基因的启动子（图6C和D）。RNA-seq和RT-qPCR分析显示，与野生型相比，Fvrif-6和Fvrif-13突变系的FvPL2、FvPG2和FvEXP3基因显著下调，表明Fvrif正调节这些基因。相反，FvXTH显示出相反的表达模式（图6，E和F），这与其之前报道的与果实软化的负相关一致。总之，这些结果表明，FvRIF在直接控制草莓果实软化相关基因方面起着正转录调节因子的作用。

图6：FvRIF介导的果实软化相关基因的直接调控

DAP-seq与RNA-seq相结合揭示了总共137个TF编码基因作为 FvRIF 的直接靶标。这些 TF 基因中只有 4 个：FvMYB10、FvSEP3、FvSPT 和 FvARF2 先前被报道参与草莓成熟的调控。FvMYB10 是花青素生物合成的关键正向调节因子， FvSEP3（一种 MADS-box TF）和 FvSPT (Spatula)，一种基本螺旋-环-螺旋 (bHLH) ) TF 对于调节果实发育和成熟是必需的。相比之下，FvARF2 对果实成熟和质量产生负向调节作用。DAP-seq 分析揭示了这 4 个 TF 基因启动子区域的 FvRIF 结合峰（图 7A）。通过酵母中的 Y1H 分析检测到 FvRIF 和所有 4 个基因的启动子之间的相互作用（图 7B）。还进行了EMSA和ChIP-qPCR测定，这支持了FvRIF在体外和体内特异性结合这些TF基因的启动子的观点（图7，C和D）。通过RNA-seq进行的表达分析（图7E）和RT-qPCR（图7F）显示，相对于野生型，在突变系（Fvrif-6和Fvrif-13）的果实中，FvMYB10、FvSEP3和FvSPT表现出降低的表达水平，而FvARF2表现出增加的表达水平。这些结果表明，FvRIF在控制果实成熟方面发挥作用。

图7：FvRIF介导的TF基因在果实成熟过程中的直接调控

作为一种经典的翻译后修饰，蛋白质磷酸化调节 TF 的活性。作者通过 KinasePhos (http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/predict.php) 对 FvRIF 中的磷酸化位点进行了预测分析。该分析预测 Thr-310 是一个假定的磷酸化位点，其同源激酶似乎是 MAPK。因此，作者假设 FvRIF 可能受到 MAPK 介导的磷酸化；用 F. vesca 中注释的 12 个 MAPK 蛋白针对 FvRIF 进行了酵母双杂交（Y2H），结果表明 FvRIF 与 FvMAPK6 相互作用，但不与任何其他 MAPK 相互作用（图 8A）。然后还利用双荧光素酶证实了这一观点（图 8B、E），这表明 FvRIF 与FvMAPK6相互作用。

图8：FvRIF和FvMAPK6之间的相互作用

作者使用 Phos-tag SDS–PAGE研究 FvRIF 是否被 FvMAPK6 磷酸化；其中用激酶 FvMKK4 作为假定的激活剂。如图9A所示，在没有被组成型活性变体FvMKK4DD激活的情况下，FvMAPK6不能磷酸化FvRIF，这表明FvMAPK6通过其上游激酶FvMKK4磷酸化诱导的激活的重要性。重要的是，FvMKK4DD 的存在导致 FvRIF (pFvRIF) 磷酸化，如 Phos-tag 凝胶中的迁移率变化所证明的那样 (图 9A)。此外，在存在 lambda 磷酸酶 (λ-PPase) 的情况下，磷酸化形式的丰度降低（图 9B），这证实了上部条带确实是由 FvMKK4-FvMAPK6 模块激活导致的磷酸化 FvRIF。

然后，作者对磷酸化FvRIF进行LC-MS分析，从而鉴定出5个高置信度磷酸化位点，Tyr-271、Ser-283、Ser-294、Ser-299和Thr-310（图9C）。定点突变分析显示，所有5个磷酸化位点（FvRIF5A）的突变显著降低了FvMAPK6依赖性pFvRIF（图9D）。进一步的分析表明，只有FvRIFT310A（Thr-310被丙氨酸取代[A]）在FvMAPK6诱导的FvRIF磷酸化中表现出显著降低，而FvRIFY271A、FvRIFS283A、FvRIFS294A和FvRIFS299A表现出很少的作用（图9D），表明Thr-310是负责FvMAPK5介导的pFvRIF的关键位点。

最后，为了确定FvRIF的转录活性是否受其磷酸化状态的调节，作者进行了GUS转录活性测定。结果如图9E所示，FvRIF激活了GUS的转录。还得出FvMAPK6依赖性pFvRIF显著增加了GUS转录，而FvRIFT310A变体完全消除了FvCHS1pro:GUS报告子的反式激活（图9E）。总之，这些数据表明，FvMKK4–FvMAPK6模块在Thr-310处的pFvRIF对正向调节其活性至关重要。

图9：FvMAPK6介导的FvRIF磷酸化发生在Thr-310

为了确认 FvRIF 磷酸化在体内调节其活性，作者在 Fvrif-13 突变体的果实中瞬时表达了各种构建体：完整的 FvRIF或其突变变体 FvRIFT310A，其中关键磷酸化位点（Thr-310）突变为A。如图10A所示，完整的FvRIF而非其突变变体FvRIFT310A挽救了Fvrif-13突变体的成熟缺陷。WB证实了FvRIF和FvRIFT310A的表达（图10B）。在瞬时表达完整FvRIF的Fvrif-13突变体的果实中，花青素含量显着增加（图10C），同时参与花青素生物合成的基因表达水平增加，包括FvCHS1、FvDFR、FvANS和FvUFGT（图10C、D）。相比之下， Fvrif-13突变体果实中花青素含量或基因表达几乎没有变化。

基于研究结果，作者提出了一个FvRIF介导的草莓果实成熟转录调控模型（图10E）。在草莓果实成熟过程中，蛋白激酶FvMAPK6作用于FvMKK4的下游，磷酸化FvRIF，从而促进其转录活性。激活的FvRIF通过直接或在ABA依赖性途径中调节成熟相关基因来控制果实成熟，这反过来又通过正调控FvRIF的表达。FvRIF还通过靶向许多TF基因（即FvMYB10、FvSEP3、FvSPT和FvARF2）发挥作用，这些基因通过控制成熟相关基因来调节果实成熟。

图10：FvRIF磷酸化是其在草莓中活化所必需的

NAC转录因子 FvRIF被认为是草莓果实成熟的关键调节因子，作者通过DAP-seq和RNA-seq得到FvRIF调控草莓花青素生物合成途径中的关键基因、参与果实软化的核心基因、参与果实成熟的TF基因；并通过ChIP-qPCR、EMSA、RT-qPCR进行了验证。还利用CO-IP、酵母双杂以及双荧光素酶验证FvRIF与与 FvMAPK6互作，并且通过LC-MS等实验得出FvRIF 的激活离不开磷酸化；提出了FvRIF介导的草莓果实成熟转录调控模型。该研究为我们提供了转录因子经典的上下游研究思路，大家可以参考着设计实验哦，有做转录因子相关的实验可以找爱基百客。

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