甲基化篇

Q1、甲基化检测方法选择？

A1：甲基化分为DNA甲基化和RNA甲基化，DNA甲基化又分为5mC和6mA。常用检测DNA的5mC方法有：WGBS（Busulfite-seq）、RRBS-seq、MeDIP-seq，而检测DNA的6mA方法为6mA-IP-seq。检测RNA甲基化的方法为m6A-IP-seq。每个方法各有千秋，WGBS（Busulfite-seq）、RRBS-seq能达到单碱基分布，但是相对来说成本会高，MeDIP-seq只能达到50bp碱基分布，但是相对费用较小。

Q2、甲基化检测需要样本重复么？

A2：最好有样本重复，避免后续数据分析产生误差。至少设置两个重复。

Q3、甲基化检测需要多少测序量？

A3：WGBS（Busulfite-seq）至少需要测30×；RRBS-seq测序10 G；MeDIP-seq需要20-30 M reads；m6A-IP-seq和6mA-IP-seq需要20-30 Mreads。

Q4、哪些因素会影响甲基化结果的质量？

A4：甲基化建库之前需要对样品进行核酸提取，核酸提取质量直接影响建库结果进而影响测序后数据质量，并且需要进行核酸提取的样品不能有污染，否则会严重影响结果的质量。

Q5、MeDIP-seq是否一定要测input组？input组设置的作用？

A5：条件允许的情况下，一定要测input组。input主要是在call peak环节，需要根据input组来判断IP组检测的peak是否显著富集。

Q6、什么是MeRIP-seq？

A6：RNA甲基化免疫共沉淀高通量测序（MeRIP）是RNA免疫共沉淀结合高通量测序的一种技术，它通过特异性抗体，免疫共沉淀甲基化修饰的RNA（m1A、m6A，m5C），然后将捕获的RNA进行高通量测序。

Q7、MeRIP-seq的应用方向？

A7、鉴定甲基化修饰的RNA（m1A、m6A，m5C）在转录组范围的分布模式。

Q8、MeRIP-seq实验具体步骤？

A8、总RNA提取，分选并打断mRNA，抗体的磁珠孵育，免疫共沉淀形成m6A抗体-RNA复合体，解交联并纯化RNA片段，构建测序文库并高通量测序分析。

Q9、 MeRIP-seq成功的关键因素？

A9：抗体的质量及用量；RNA的用量及孵育时间。

Q10、MeRIP-seq采用的测序策略？

A10：PE150。

Q11、如何判断MeRIP-seq是否成功？

A11：查阅文献，确定存在修饰的RNA序列，设计引物，用qPCR验证Input和IP之间，是否存在富集。

Q12：MeRIP实验富集下来的RNA涉及到哪几种步骤

A12：纯化、反转录、测序文库构建。

Q13、甲基化发生位置？

A13：DNA中含有很多CpG结构，2CpG和3CpG中的两个胞嘧啶的5为碳原子通常被甲基化，且两个甲基集团在DNA双链大沟中呈现特定的三维结构。基因组中60%—90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。而DNA的6-腺嘌呤甲基化目前并未报道具体发生在什么位置，有的真核生物6mA主要位于具有A-T序列基序的核小体-连接体DNA中，但并非所有生物如此，具体情况还需进一步研究报道。